成骨性肿瘤中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原蛋白的表达
作者：张惠忠 丘钜世※ 朱全胜
单位：张惠忠，中山医科大学肿瘤防治中心病理科(广州，510060)；丘钜世※ 朱全胜，中山医科大学病理教研室 ※通讯作者
关键词：成骨性肿瘤；胶原
癌症990513
【摘 要】 目的：研究成骨性肿瘤组织中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原蛋白的表达及与肿瘤分类、分化的关系。方法：用饱和苦味酸-天狼星红-偏振光镜和免疫组化LSAB法，检测69例成骨性肿瘤组织中Ⅰ、Ⅱ、和Ⅲ型胶原的表达情况，并用EMAL-200真彩图像分析系统进行分析和半定量测定。结果：骨瘤和骨样骨瘤中只有Ⅰ型胶原的表达(阳性率均为100%，灰度值分别为133.13±7.47和136.49±14.21)，而骨肉瘤不仅Ⅰ型胶原阳性率和强度均明显低于前二者(阳性率87%，40/46，灰度值171.99±14.74)，且出现了Ⅱ型和Ⅲ型胶原，Ⅱ型胶原在软骨母细胞型和混合型的表达明显高于其它型骨肉瘤(P<0.01)，而Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达在各型骨肉瘤间无显著差别；在高中低3组不同分化程度的骨肉瘤间，Ⅰ型胶原表达差异显著(P<0.01)，分化越低表达越少；天狼星红与免疫组化染色结果基本一致。结论：Ⅱ型胶原可作为软骨母细胞型和混合型骨肉瘤的分型参考指标，Ⅰ型胶原的表达可作为骨肉瘤分化的参考指标。天狼星红是鉴别Ⅰ、Ⅲ型胶原简便、经济的方法之一。
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中图分类号：R738.1 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)05-0531-04
Expression of type Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ collagen in bone-forming tumor
ZHANG Hui-zhong,QIU Ju-shi,ZHU Quan-sheng
Department of Pathology,Cancer Center of Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510060,P.R. China
【Abstract】 Objective：To investigate expression of type Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ collagen in bone forming tumors and their relationship with classification and differentiation of tumor. Methods：Type Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ collagen in 69 cases of osteogenous tumor (including 15 cases of osteoma, 8 osteoid osteoma and 46 osteosarcoma) were detected using picric acid-sirius red-polariscope and immunohistochemistry,the EMAL-200 image software was used to analyse the staining result. Results：Only type I collagen was positive in osteoma and osteoid osteoma (positive rates of type I collagen in both tumors were all 100%,grey values were 133.13± 7.47 and 136.49± 14.21 respectively),expression of type I collagen in osteosarcoma (positive rate 87%,grey value 171.99± 14.74) was significantly weaker than that in osteoma and osteoid osteoma.Besides type Ⅰ,type Ⅱ and Ⅲ collagen were also detected in osteosarcomas. Type Ⅱ collagen stain was significantly stronger in chondroblastic and mixed than other type osteosarcomas. Among the three groups of osteosarcomas of high,moderate and low degree,the difference of type Ⅰ collagen was statistically significant demonstrating that the lower the osteosarcoma differentiate,the weaker the expression of type Ⅰ collagen was. Conclusion：Type Ⅱ collagen can be utilized as one of the indicators to diagnose chondroblastic and mixed osteosarcomas.Type Ⅰ collagen can be used as one of the markers to determine the differentiation of ostecosarcoma. Picric acid-sirius red-polariscope is a simple and ecnomic method to identify type Ⅰ and type Ⅲ collagen.
, 百拇医药
Key words：Bone-forming tumor；Collagen
胶原是细胞外基质的主要成分，它代表了一个结构相关，有独特的组织分布和功能的蛋白质家族，以往认为，胶原只是组织中一种起支持作用的结构蛋白。随着分子生物学的发展及对胶原研究的深入，发现胶原具有复杂的生物学功能，影响着细胞的增生、分化、粘附、形态发生和表型表达，因而越来越受到研究者重视。
正常骨组织中只有Ⅰ型胶原，软骨中主要是Ⅱ型胶原。然而在骨肿瘤发生后，其胶原的量及类型是否发生改变?这种改变与骨肿瘤分类、分化及预后是否有关?本实验将对此进行一些探讨。
1 材料与方法
1.1 标本
收集1992年至1996年间中山医科大学病理教研室及肿瘤医院病理科石蜡保存人骨肿瘤标本69例，其中骨瘤15例，骨样骨瘤8例，骨肉瘤46例。男39例，女30例，年龄最大68岁，最小6岁，所有病例均经病理确诊。
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1.2 方法
1.2.1 饱和苦味酸-天狼星红-偏振光法：切片常规脱蜡水化，经饱和苦味酸天狼星红染色1小时，脱水，透明，封片。结果判定：在偏振光显微镜下观察，黑色背景中呈粗大红色或黄色纤维为Ⅰ型胶原，纤细的呈网状的绿色纤维为Ⅲ型胶原，Ⅱ型胶原在偏振光下不显色。胶原的定量以正常骨骨小梁胶原量为标准(++++)，按某型胶原与正常骨小梁胶原的百分比(0，25%以下，26%～50%，51%～75%，76～100%)依次定为：-，+,++,+++，++++。
1.2.2 免疫组化LSAB法：用Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原抗体，检测骨肿瘤组织中胶原的表达情况；主要试剂来源：Ⅰ、Ⅲ型胶原抗体(兔抗人)购自BOSTER公司，Ⅱ型胶原抗体(鼠抗人)购自NEOMARKER公司，LSAB检测试剂盒为DAKO公司产品。对照设定：用PBS代替一抗作为抗体的阴性对照，用人的皮肤和支气管软骨分别作Ⅰ，Ⅲ型及Ⅱ型胶原的阳性对照组织。结果判定：间质或细胞浆出现棕黄或深棕色者为阳性反应。
, 百拇医药
1.2.3 图象分析：用EMAL——200真彩图像分析系统对阳性染色的强度(灰度值)进行半定量测定，灰度值(相对值)与阳性强度成反比，灰度值越小染色越强。
1.2.4 统计学分析：计量资料组间比较用方差分析；计数等级资料用秩和检验。
2 结果
2.1 苦味酸—天狼星红—偏振光镜观察结果
骨瘤和骨样骨瘤仅见Ⅰ型胶原，阳性率均为100%，骨肉瘤中不仅有Ⅰ型胶原表达，而且有Ⅲ型胶原的表达，其阳性率分别为87%和37%；从Ⅰ型胶原表达的量和形态来看，骨瘤与正常骨质完全相同，均为粗大且排列规则的纤维，定量均为(++++)，骨样骨瘤表达的量比骨瘤少些，纤维也没有骨瘤那么粗大和均一，其定量6例为(+++)，而(+)和(++)各1例；骨肉瘤Ⅰ型胶原的表达总的来说比骨瘤和骨样骨瘤都少(图1)，其量及形态变化更为多样，有的较粗大，有的纤细如丝状，或呈针状或点状，排列不规则；Ⅲ型胶原主要分布在类骨小梁的边沿，偶见于小梁中央。
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经统计学分析，骨瘤与骨样骨瘤间Ⅰ型胶原表达无明显差异，然而二者与骨肉瘤间却有明显差异，前者明显高于后者(P<0.05)。将骨肉瘤按组织学形态分以下几型进行比较：骨母细胞型，软骨母细胞型，纤维母细胞型，血管扩张型，小圆细胞型及混合型，同时按分化程度分高、中、低三级；Ⅱ型胶原在软骨母细胞型和混合型的表达明显高于其它型骨肉瘤(P<0.01)，Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达在各型骨肉瘤间无明显差异(P=0.741)；但分化程度不同的三组骨肉瘤间Ⅰ型胶原表达差异显著(P=0.004)，分化越差表达越弱，Ⅱ、Ⅲ型胶原表达无此差异。
2.2 免疫组化染色结果
Ⅰ型胶原表达阳性率，骨瘤和骨样骨瘤均为100%，骨肉瘤为87%；Ⅱ、Ⅲ型胶原骨瘤和骨样骨瘤均阴性，骨肉瘤Ⅱ、Ⅲ型胶原阳性率分别为30.43%和43.5%。Ⅰ型胶原与Ⅲ型胶原分布部位基本相同，主要分布在类骨质(钙化区不着色)或瘤细胞周围(图2)，在软骨区基质中(特别是软骨区边缘非成熟区)亦有较多的Ⅰ型和Ⅲ型胶原分布(图3)，此外瘤细胞胞浆内也有阳性，Ⅱ型胶原主要分布在软骨区的基质中(特别是中央成熟区)(图4)，部分瘤细胞胞浆内也有表达。
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经图像分析测定免疫组化染色的灰度值并进行方差分析(表1)，发现Ⅰ型胶原的表达在骨瘤和骨样骨瘤间无明显差异，但二者的表达明显强于骨肉瘤；Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达在骨肉瘤各型间比较差异不显著，Ⅱ型胶原以软骨母细胞和混合型最强，与其它型骨肉瘤比较差异显著；在高、中、低分化的骨肉瘤之间，Ⅰ型胶原的差别显著(表2)，即分化越高表达越强，分化越低表达越弱，而Ⅱ型和Ⅲ型胶原却无此差别。从上述结果可以看出，免疫组化和天狼星红染色得出的结果基本相同。
表1 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原免疫组化及图象分析结果在三种成骨性肿瘤间的比较 类型
例数
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
阳性数
, 百拇医药
灰度值
阳性数
灰度值
阳性数
灰度值
骨 瘤
15
15
133.13±7.47
0
(-)
0
(-)
, 百拇医药
骨样骨瘤
8
8
136.49±14.21
0
(-)
0
(-)
骨肉瘤
46
40
171.99±14.74
14
, 百拇医药
153.07±18.82
20
168.29±8.36
统计结果
F=60.18
P<0.01
图1 饱和苦味酸天狼星红偏振光显微镜结果(×200)，示骨肉瘤类骨质中Ⅰ、Ⅲ型胶原，较粗大的黄色和红色者为Ⅰ型胶原，纤细的绿色为Ⅲ型胶原。
图2 骨肉瘤免疫组化Ⅰ型胶原染色(×100)，Ⅰ型胶原主要位于类骨质(钙化区没染上)，瘤细胞周围及瘤细胞亦见着色。
, 百拇医药
图3 骨肉瘤(软骨母细胞型)免疫组化Ⅲ型胶原(×100)，示Ⅲ型胶原分布于软骨区边缘。
图4 骨肉瘤(软骨母细胞型)免疫化Ⅱ型胶原(×100)，软骨区中央强阳性。
表2Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原免疫组化结果在三组不同分化程度骨肉瘤间的比较 分级
例数
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
阳性数
灰度值
阳性数
灰度值
, 百拇医药
阳性数
灰度值
高
15
15
157.38±9.54
7
172.89±26.03
9
183.58±17.42
中
18
15
, 百拇医药
173.58±12.61
5
183.06±19.39
5
184.45±17.61
低
13
10
186.59±6.92
2
187.49±20.96
6
, http://www.100md.com 184.11±16.62
统计结果
F=34.32
P<0.01
F=1.91
P=0.16>0.05
F=0.01
P=0.99>0.05
3 讨论
正常骨小梁组织中只有Ⅰ型胶原，排列规则，当骨母细胞发生转化后，其胶原产生的量和形态都发生变化，那么这种改变的实质是什么呢?实验室中有人发现〔1〕，转化后的骨母细胞其α1(Ⅰ)mRNA水平下降，而胶原受体—α2β1整合素(integrin)却相应增加，说明细胞转化后，胶原在转录水平受到调节。Oshima〔2〕将人成骨肉瘤细胞种植到裸鼠，长出的肿瘤与人软骨肉瘤相同，经检测发现瘤细胞产生Ⅰ型和Ⅱ型胶原mRNA；本研究小组曾对骨肉瘤细胞株OS-732和HOS-863进行研究，发现转化后细胞中α1(Ⅰ)mRNA水平和前胶原多肽合成明显减少。我们的实验结果显示，人体骨瘤和骨样骨瘤的胶原量和排列基本正常，均为Ⅰ型胶原，而骨肉瘤Ⅰ型胶原的量明显减少，形态排列不规则，除Ⅰ型胶原外，还出现了Ⅱ型和Ⅲ型胶原，说明骨肉瘤胶原基因表达的改变及多样化。Ueda等〔3〕用免疫组化方法检测6例软骨瘤和9例软骨肉瘤发现，软骨瘤基质中无Ⅰ、Ⅲ型胶原，而软骨肉瘤中却出现了Ⅰ型和Ⅲ型胶原。Lehmann〔4〕对4例骨肉瘤的研究发现都(4/4)含较高的Ⅲ型胶原，其中3例的Ⅰ、Ⅲ型胶原都有过度修饰，我们的实验结果与其相似。此外我们还发现，骨肉瘤软骨化区边缘未成熟区有较多Ⅰ型与Ⅲ型胶原分布，Ⅱ型胶原则以软骨中央成熟区最强，由此可见，与正常软骨相比，骨肉瘤中的软骨成分不单是形态上的不成熟，而且其基质所含成分也不同，正常软骨只有Ⅱ型胶原，而没有Ⅰ、Ⅲ型胶原。
, 百拇医药
有关胶原表达与骨肉瘤分型和分化的关系，尚未见文献报道。本实验结果表明，Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达与骨肉瘤类型无明显相关，而Ⅱ型胶原在软骨母细胞型和混合型中的表达明显高于其它型骨肉瘤，因此可作为该两型骨肉瘤分型的参考指标。在分级方面，高、中、低三组骨肉瘤间Ⅰ型胶原的表达差异显著，即分化越低，Ⅰ型胶原表达越弱，而Ⅱ、Ⅲ型胶原却没有发现这种相关，因此Ⅰ型胶原可作为判断骨肉瘤分级(分化)的参考指标。
本实验用天狼星红染色与免疫组化结果基本一致，但免疫组化对细小纤维及细胞内胶原蛋白的检测更敏感。不过，天狼星红染色方法简便，价格便宜，仍不失为鉴别Ⅰ型和Ⅲ型胶原的有效方法。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(批号：39770301)
〔参考文献〕
〔1〕 Santala P,Larjava H,Nissinen L,et al. Suppressed collagen gene expression and induction of α2β1 integrin-type collagen receptor in tumorigenic derivatives of human osteogenetic sarcoma(HOS) cell line〔J〕. J Bio Chem, 1994,269(2)：1276～1283.
, 百拇医药
〔2〕 Oshima O,Haraki T,Kakuta S,et al. Expression of collagen species in a cartilaginous tumor derived from a human osteogenic sarcoma〔J〕. Calcif Tissue Int,1994,54(6)：516～520.
〔3〕 Ueda Y,Oda Y,Tsuchiya H,et al.Immunohistological study on collagenous protein of benign and malignant human cartilaginous tumors of bone〔J〕. Virchows Archiv A Pathol Anat Histopathol,1990,417：291～297.
〔4〕 Lehmann HW,Wolf E,Roser K,et al. Composition and posttranslational modification of individual collagen chains from osteosarcoma and osteofibrous dysplasias〔J〕. J Cancer Res Clin Oncol 1995,121(7)：413～418.
收稿日期：1999-01-15；修回日期：1999-04-28, 百拇医药
单位：张惠忠，中山医科大学肿瘤防治中心病理科(广州，510060)；丘钜世※ 朱全胜，中山医科大学病理教研室 ※通讯作者
关键词：成骨性肿瘤；胶原
癌症990513
【摘 要】 目的：研究成骨性肿瘤组织中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原蛋白的表达及与肿瘤分类、分化的关系。方法：用饱和苦味酸-天狼星红-偏振光镜和免疫组化LSAB法，检测69例成骨性肿瘤组织中Ⅰ、Ⅱ、和Ⅲ型胶原的表达情况，并用EMAL-200真彩图像分析系统进行分析和半定量测定。结果：骨瘤和骨样骨瘤中只有Ⅰ型胶原的表达(阳性率均为100%，灰度值分别为133.13±7.47和136.49±14.21)，而骨肉瘤不仅Ⅰ型胶原阳性率和强度均明显低于前二者(阳性率87%，40/46，灰度值171.99±14.74)，且出现了Ⅱ型和Ⅲ型胶原，Ⅱ型胶原在软骨母细胞型和混合型的表达明显高于其它型骨肉瘤(P<0.01)，而Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达在各型骨肉瘤间无显著差别；在高中低3组不同分化程度的骨肉瘤间，Ⅰ型胶原表达差异显著(P<0.01)，分化越低表达越少；天狼星红与免疫组化染色结果基本一致。结论：Ⅱ型胶原可作为软骨母细胞型和混合型骨肉瘤的分型参考指标，Ⅰ型胶原的表达可作为骨肉瘤分化的参考指标。天狼星红是鉴别Ⅰ、Ⅲ型胶原简便、经济的方法之一。
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中图分类号：R738.1 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)05-0531-04
Expression of type Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ collagen in bone-forming tumor
ZHANG Hui-zhong,QIU Ju-shi,ZHU Quan-sheng
Department of Pathology,Cancer Center of Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510060,P.R. China
【Abstract】 Objective：To investigate expression of type Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ collagen in bone forming tumors and their relationship with classification and differentiation of tumor. Methods：Type Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ collagen in 69 cases of osteogenous tumor (including 15 cases of osteoma, 8 osteoid osteoma and 46 osteosarcoma) were detected using picric acid-sirius red-polariscope and immunohistochemistry,the EMAL-200 image software was used to analyse the staining result. Results：Only type I collagen was positive in osteoma and osteoid osteoma (positive rates of type I collagen in both tumors were all 100%,grey values were 133.13± 7.47 and 136.49± 14.21 respectively),expression of type I collagen in osteosarcoma (positive rate 87%,grey value 171.99± 14.74) was significantly weaker than that in osteoma and osteoid osteoma.Besides type Ⅰ,type Ⅱ and Ⅲ collagen were also detected in osteosarcomas. Type Ⅱ collagen stain was significantly stronger in chondroblastic and mixed than other type osteosarcomas. Among the three groups of osteosarcomas of high,moderate and low degree,the difference of type Ⅰ collagen was statistically significant demonstrating that the lower the osteosarcoma differentiate,the weaker the expression of type Ⅰ collagen was. Conclusion：Type Ⅱ collagen can be utilized as one of the indicators to diagnose chondroblastic and mixed osteosarcomas.Type Ⅰ collagen can be used as one of the markers to determine the differentiation of ostecosarcoma. Picric acid-sirius red-polariscope is a simple and ecnomic method to identify type Ⅰ and type Ⅲ collagen.
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Key words：Bone-forming tumor；Collagen
胶原是细胞外基质的主要成分，它代表了一个结构相关，有独特的组织分布和功能的蛋白质家族，以往认为，胶原只是组织中一种起支持作用的结构蛋白。随着分子生物学的发展及对胶原研究的深入，发现胶原具有复杂的生物学功能，影响着细胞的增生、分化、粘附、形态发生和表型表达，因而越来越受到研究者重视。
正常骨组织中只有Ⅰ型胶原，软骨中主要是Ⅱ型胶原。然而在骨肿瘤发生后，其胶原的量及类型是否发生改变?这种改变与骨肿瘤分类、分化及预后是否有关?本实验将对此进行一些探讨。
1 材料与方法
1.1 标本
收集1992年至1996年间中山医科大学病理教研室及肿瘤医院病理科石蜡保存人骨肿瘤标本69例，其中骨瘤15例，骨样骨瘤8例，骨肉瘤46例。男39例，女30例，年龄最大68岁，最小6岁，所有病例均经病理确诊。
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1.2 方法
1.2.1 饱和苦味酸-天狼星红-偏振光法：切片常规脱蜡水化，经饱和苦味酸天狼星红染色1小时，脱水，透明，封片。结果判定：在偏振光显微镜下观察，黑色背景中呈粗大红色或黄色纤维为Ⅰ型胶原，纤细的呈网状的绿色纤维为Ⅲ型胶原，Ⅱ型胶原在偏振光下不显色。胶原的定量以正常骨骨小梁胶原量为标准(++++)，按某型胶原与正常骨小梁胶原的百分比(0，25%以下，26%～50%，51%～75%，76～100%)依次定为：-，+,++,+++，++++。
1.2.2 免疫组化LSAB法：用Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原抗体，检测骨肿瘤组织中胶原的表达情况；主要试剂来源：Ⅰ、Ⅲ型胶原抗体(兔抗人)购自BOSTER公司，Ⅱ型胶原抗体(鼠抗人)购自NEOMARKER公司，LSAB检测试剂盒为DAKO公司产品。对照设定：用PBS代替一抗作为抗体的阴性对照，用人的皮肤和支气管软骨分别作Ⅰ，Ⅲ型及Ⅱ型胶原的阳性对照组织。结果判定：间质或细胞浆出现棕黄或深棕色者为阳性反应。
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1.2.3 图象分析：用EMAL——200真彩图像分析系统对阳性染色的强度(灰度值)进行半定量测定，灰度值(相对值)与阳性强度成反比，灰度值越小染色越强。
1.2.4 统计学分析：计量资料组间比较用方差分析；计数等级资料用秩和检验。
2 结果
2.1 苦味酸—天狼星红—偏振光镜观察结果
骨瘤和骨样骨瘤仅见Ⅰ型胶原，阳性率均为100%，骨肉瘤中不仅有Ⅰ型胶原表达，而且有Ⅲ型胶原的表达，其阳性率分别为87%和37%；从Ⅰ型胶原表达的量和形态来看，骨瘤与正常骨质完全相同，均为粗大且排列规则的纤维，定量均为(++++)，骨样骨瘤表达的量比骨瘤少些，纤维也没有骨瘤那么粗大和均一，其定量6例为(+++)，而(+)和(++)各1例；骨肉瘤Ⅰ型胶原的表达总的来说比骨瘤和骨样骨瘤都少(图1)，其量及形态变化更为多样，有的较粗大，有的纤细如丝状，或呈针状或点状，排列不规则；Ⅲ型胶原主要分布在类骨小梁的边沿，偶见于小梁中央。
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经统计学分析，骨瘤与骨样骨瘤间Ⅰ型胶原表达无明显差异，然而二者与骨肉瘤间却有明显差异，前者明显高于后者(P<0.05)。将骨肉瘤按组织学形态分以下几型进行比较：骨母细胞型，软骨母细胞型，纤维母细胞型，血管扩张型，小圆细胞型及混合型，同时按分化程度分高、中、低三级；Ⅱ型胶原在软骨母细胞型和混合型的表达明显高于其它型骨肉瘤(P<0.01)，Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达在各型骨肉瘤间无明显差异(P=0.741)；但分化程度不同的三组骨肉瘤间Ⅰ型胶原表达差异显著(P=0.004)，分化越差表达越弱，Ⅱ、Ⅲ型胶原表达无此差异。
2.2 免疫组化染色结果
Ⅰ型胶原表达阳性率，骨瘤和骨样骨瘤均为100%，骨肉瘤为87%；Ⅱ、Ⅲ型胶原骨瘤和骨样骨瘤均阴性，骨肉瘤Ⅱ、Ⅲ型胶原阳性率分别为30.43%和43.5%。Ⅰ型胶原与Ⅲ型胶原分布部位基本相同，主要分布在类骨质(钙化区不着色)或瘤细胞周围(图2)，在软骨区基质中(特别是软骨区边缘非成熟区)亦有较多的Ⅰ型和Ⅲ型胶原分布(图3)，此外瘤细胞胞浆内也有阳性，Ⅱ型胶原主要分布在软骨区的基质中(特别是中央成熟区)(图4)，部分瘤细胞胞浆内也有表达。
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经图像分析测定免疫组化染色的灰度值并进行方差分析(表1)，发现Ⅰ型胶原的表达在骨瘤和骨样骨瘤间无明显差异，但二者的表达明显强于骨肉瘤；Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达在骨肉瘤各型间比较差异不显著，Ⅱ型胶原以软骨母细胞和混合型最强，与其它型骨肉瘤比较差异显著；在高、中、低分化的骨肉瘤之间，Ⅰ型胶原的差别显著(表2)，即分化越高表达越强，分化越低表达越弱，而Ⅱ型和Ⅲ型胶原却无此差别。从上述结果可以看出，免疫组化和天狼星红染色得出的结果基本相同。
表1 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原免疫组化及图象分析结果在三种成骨性肿瘤间的比较 类型
例数
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
阳性数
, 百拇医药
灰度值
阳性数
灰度值
阳性数
灰度值
骨 瘤
15
15
133.13±7.47
0
(-)
0
(-)
, 百拇医药
骨样骨瘤
8
8
136.49±14.21
0
(-)
0
(-)
骨肉瘤
46
40
171.99±14.74
14
, 百拇医药
153.07±18.82
20
168.29±8.36
统计结果
F=60.18
P<0.01
图1 饱和苦味酸天狼星红偏振光显微镜结果(×200)，示骨肉瘤类骨质中Ⅰ、Ⅲ型胶原，较粗大的黄色和红色者为Ⅰ型胶原，纤细的绿色为Ⅲ型胶原。
图2 骨肉瘤免疫组化Ⅰ型胶原染色(×100)，Ⅰ型胶原主要位于类骨质(钙化区没染上)，瘤细胞周围及瘤细胞亦见着色。
, 百拇医药
图3 骨肉瘤(软骨母细胞型)免疫组化Ⅲ型胶原(×100)，示Ⅲ型胶原分布于软骨区边缘。
图4 骨肉瘤(软骨母细胞型)免疫化Ⅱ型胶原(×100)，软骨区中央强阳性。
表2Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原免疫组化结果在三组不同分化程度骨肉瘤间的比较 分级
例数
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
阳性数
灰度值
阳性数
灰度值
, 百拇医药
阳性数
灰度值
高
15
15
157.38±9.54
7
172.89±26.03
9
183.58±17.42
中
18
15
, 百拇医药
173.58±12.61
5
183.06±19.39
5
184.45±17.61
低
13
10
186.59±6.92
2
187.49±20.96
6
, http://www.100md.com 184.11±16.62
统计结果
F=34.32
P<0.01
F=1.91
P=0.16>0.05
F=0.01
P=0.99>0.05
3 讨论
正常骨小梁组织中只有Ⅰ型胶原，排列规则，当骨母细胞发生转化后，其胶原产生的量和形态都发生变化，那么这种改变的实质是什么呢?实验室中有人发现〔1〕，转化后的骨母细胞其α1(Ⅰ)mRNA水平下降，而胶原受体—α2β1整合素(integrin)却相应增加，说明细胞转化后，胶原在转录水平受到调节。Oshima〔2〕将人成骨肉瘤细胞种植到裸鼠，长出的肿瘤与人软骨肉瘤相同，经检测发现瘤细胞产生Ⅰ型和Ⅱ型胶原mRNA；本研究小组曾对骨肉瘤细胞株OS-732和HOS-863进行研究，发现转化后细胞中α1(Ⅰ)mRNA水平和前胶原多肽合成明显减少。我们的实验结果显示，人体骨瘤和骨样骨瘤的胶原量和排列基本正常，均为Ⅰ型胶原，而骨肉瘤Ⅰ型胶原的量明显减少，形态排列不规则，除Ⅰ型胶原外，还出现了Ⅱ型和Ⅲ型胶原，说明骨肉瘤胶原基因表达的改变及多样化。Ueda等〔3〕用免疫组化方法检测6例软骨瘤和9例软骨肉瘤发现，软骨瘤基质中无Ⅰ、Ⅲ型胶原，而软骨肉瘤中却出现了Ⅰ型和Ⅲ型胶原。Lehmann〔4〕对4例骨肉瘤的研究发现都(4/4)含较高的Ⅲ型胶原，其中3例的Ⅰ、Ⅲ型胶原都有过度修饰，我们的实验结果与其相似。此外我们还发现，骨肉瘤软骨化区边缘未成熟区有较多Ⅰ型与Ⅲ型胶原分布，Ⅱ型胶原则以软骨中央成熟区最强，由此可见，与正常软骨相比，骨肉瘤中的软骨成分不单是形态上的不成熟，而且其基质所含成分也不同，正常软骨只有Ⅱ型胶原，而没有Ⅰ、Ⅲ型胶原。
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有关胶原表达与骨肉瘤分型和分化的关系，尚未见文献报道。本实验结果表明，Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达与骨肉瘤类型无明显相关，而Ⅱ型胶原在软骨母细胞型和混合型中的表达明显高于其它型骨肉瘤，因此可作为该两型骨肉瘤分型的参考指标。在分级方面，高、中、低三组骨肉瘤间Ⅰ型胶原的表达差异显著，即分化越低，Ⅰ型胶原表达越弱，而Ⅱ、Ⅲ型胶原却没有发现这种相关，因此Ⅰ型胶原可作为判断骨肉瘤分级(分化)的参考指标。
本实验用天狼星红染色与免疫组化结果基本一致，但免疫组化对细小纤维及细胞内胶原蛋白的检测更敏感。不过，天狼星红染色方法简便，价格便宜，仍不失为鉴别Ⅰ型和Ⅲ型胶原的有效方法。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(批号：39770301)
〔参考文献〕
〔1〕 Santala P,Larjava H,Nissinen L,et al. Suppressed collagen gene expression and induction of α2β1 integrin-type collagen receptor in tumorigenic derivatives of human osteogenetic sarcoma(HOS) cell line〔J〕. J Bio Chem, 1994,269(2)：1276～1283.
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〔2〕 Oshima O,Haraki T,Kakuta S,et al. Expression of collagen species in a cartilaginous tumor derived from a human osteogenic sarcoma〔J〕. Calcif Tissue Int,1994,54(6)：516～520.
〔3〕 Ueda Y,Oda Y,Tsuchiya H,et al.Immunohistological study on collagenous protein of benign and malignant human cartilaginous tumors of bone〔J〕. Virchows Archiv A Pathol Anat Histopathol,1990,417：291～297.
〔4〕 Lehmann HW,Wolf E,Roser K,et al. Composition and posttranslational modification of individual collagen chains from osteosarcoma and osteofibrous dysplasias〔J〕. J Cancer Res Clin Oncol 1995,121(7)：413～418.
收稿日期：1999-01-15；修回日期：1999-04-28, 百拇医药