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编号:10285312
微波烘疗对原发性淋巴水肿免疫细胞的影响
http://www.100md.com 《癌症》 1999年第1期
     作者:曹卫刚 张涤生 干季良

    单位:200011 上海第九人民医院整复外科

    关键词:淋巴水肿;微波烘疗;免疫组化

    癌症990111

    【摘要】目的:研究癌性胸水细胞中的端粒酶活性。方法:采用PCRTRAP方法检测癌性胸水细胞标本中的端粒酶活性,并将检测结果与细胞学诊断结果进行比较。结果:57例诊断明确的癌性胸水细胞标本经细胞学检查和端粒酶活性检测发现:在43例肺癌胸水标本中,29例细胞学阳性胸水有27例端粒酶阳性,3例细胞学可疑胸水有2例端粒酶阳性,11例细胞学阴性胸水有4例端粒酶阳性。在14例其它肿瘤胸水标本中,8例细胞学阳性及1例细胞学可疑胸水标本端粒酶检测均为阳性,5例细胞学阴性胸水有1例端粒酶阳性。细胞学诊断和端粒酶检测总阳性率分别为64.91%(37/57)和75.44%(43/57)。结论:结果提示端粒酶活性检测可能在癌性胸水诊断和鉴别诊断方面有重要辅助诊断价值。
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    中图号:R734.2;R70.43;Q55

    Detection of telomerase activity in pleural effusion cells

    from patients with malignant neoplasms

    Zhang Wei Jin Shunqian Liu Yi, et al

    Cancer Institute, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, PeKing Union Medical Collgeg, Beijing 100021

    【Abstract】 Purpose: To study the telomerase activity in pleural effusion cells from patients with malignant neoplams. Method: Fifty-seven specimens of pleural effusion cells from patients with malignant neoplasms were examined for telomerase activity by PCR-based TRAP (telomeric repeat amplification protocol) method, and the result of detecting telomerase activity was compared with the cytological diagnosis. Results: Telomerase activity was detected in pleural effusion cells from patients with lung cancer in 27 of 29 cytologic-positive specimens and in 2 of 3 cytologic-suspicious specimens and in 4 of 11 cytologic-negative specimens, and in pleural effusion cells from patients with other tumorus in all 8 cytologic-positive specimens and in 1 cytologic-suspicious specimens and in 1 of 5 cytologic-negative specimens. The overall positive rate in 57 pleural effusion cells samples by cytological examination and by the detection of telomerase activity is 64.91% (37/57) and 75.44% 43/57), respectively. Conclusions: The results suggest that measuring telomerase activity of pleural effusion cells would be helpful for the cytological examination in diagnosis of patients with malignant neoplasms.
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    Key words: Tumor; Pleural effusion; Telomerase; Polymerase chain reaction

    端粒酶(Telomerase)是当前国际上肿瘤标志物最热门的研究课题之一[1]。1994年,Kim利用PCR技术建立了高敏感的TRAP(telomeric repeat amplification protocol)端粒酶活性检测技术[2],现已广泛应用于恶性肿瘤的端粒酶活性研究。本室采用该技术,检测了57例癌性胸水细胞标本中的端粒酶活性,并将检测结果与细胞学诊断结果进行比较,旨在探讨该项技术指标在胸水癌细胞检测中的临床意义。

    1 材料与方法

    1.1标本来源

    57例癌性胸水标本,包括43例肺癌,3例乳腺癌,3例卵巢癌,2例贲门癌,1例食管癌,1例甲状腺癌,2例恶性淋巴瘤,1例胸腺癌和1例胸腺瘤胸水标本,均来自我院1997年7月至11月的住院肿瘤患者。其中,15例肺癌和14例其它肿瘤由病理学诊断证实,其余28例肺癌由影像学和细胞学及其它临床辅助检查证实。胸水收集前2~3周内患者均未接受静脉或胸腔化疗,标本获取后,60分钟内送细胞学检查、细胞分离及端粒酶提取。
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    1.2细胞学诊断

    细胞学诊断由我院细胞学室作出。取20ml胸水标本。2000rpm离心10分钟弃上清,取表面细胞层涂片,晾干后用95%乙醇固定细胞20分钟。玻片用巴氏、HE、MGG3种方法同时染色,染色后在光镜下进行细胞学诊断。

    1.3端粒酶提取

    取50ml胸水标本,2000rpm4℃离心5分钟。细胞沉淀用冷PBS洗涤2次后,加入200μl预冷的端粒酶裂解液[10mmol/LTris-HCl(pH7-5),1mmol/LMgCl2,1mmol/LEGTA,5mmol/L二巯基乙醇,0.5%CHAPS,10%甘油],混匀后在0℃裂解30分钟,13500rpm4℃离心30分钟,吸取上清至一新预冷管。采用BCA试剂盒(Sigma产品)做蛋白质含量测定,置-80℃冰箱冻存。

    1.4端粒酶活性检测
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    采用TRAP方法检测端粒酶活性[2]。25μl反应体积内含20mmol/LTrisHCl(pH83),1mmol/LMgCl2,63mmol/LKCl,0.005%Tween-20,1mmol/LEGTA,50μmol/LdNTP,1μgT4基因32蛋白,0.1μg/mlBSA,2μCi(74kBqα32P-dCTP,2UTaq酶和0.1μgTS引物(5’-AATCCGTCGAGC-AGAGTT-3’)。加6μg端粒酶提取物,混匀后30℃保温30分钟,90℃90秒灭活端粒酶。加0.1μgCX引物(5’-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3’),混匀后覆盖石蜡油,在PE480PCR仪上进行31个循环,循环参数为94℃40秒,50℃40秒,72℃50秒,最后于72℃延长10分钟。PCR产物在10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳后,凝胶与X光胶片置-80℃放射自显影,12小时后显示结果。检测时以肺癌细胞系GLC蛋白提取物作为阳性对照,阴性对照在反应液中仅加端粒酶裂解液。细胞学诊断和端粒酶活性检测采用双盲法。
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    2 结果

    2.1癌性胸水细胞学诊断和端粒酶活性检测结果

    端粒酶阳性标本为间隔6bp的梯形带(见附图)。在57例癌性胸水标本中,经细胞学证实37例有癌细胞,阳性率为64.91%(37/57);4例胸水标本发现有可疑癌细胞,其余16例未见癌细胞。经端粒酶活性检测发现,在57例癌性胸水标本中,43例检测到端粒酶活性,阳性率为75.44%(43/57),见表1。

    附图 癌性胸水细胞端粒酶活性检测结果

    P:肺癌细胞系GLC为阳性对照

    L:端粒酶裂解缓冲液为阴性对照

    1~13:癌性胸水细胞标本。1~7,9~13为端粒酶阳性。8为端粒酶阴性。
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    表1 癌性胸水标本细胞学诊断和端粒酶活性检测结果 胸水来源

    病例数

    细胞学诊断

    端粒酶活性检测

    阳性

    可疑

    阴性

    阳性率(%)

    阳性

    阴性

    阳性率(%)

    肺癌

, 百拇医药     43

    29

    3

    11

    67.44

    33

    10

    76.74

    乳腺癌

    3

    3

    0

    0

    -
, 百拇医药
    3

    0

    -

    卵巢癌

    3

    2

    0

    1

    -

    2

    1

    -

    贲门癌

    2
, 百拇医药
    2

    0

    0

    -

    2

    0

    -

    食管癌

    1

    0

    0

    1

    -

    1
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    0

    -

    甲状腺癌

    1

    0

    0

    1

    -

    0

    1

    -

    淋巴瘤

    2

    1
, 百拇医药
    1

    0

    -

    2

    0

    -

    胸腺癌

    1

    0

    0

    1

    -

    0

    1
, 百拇医药
    -

    胸腺瘤

    1

    0

    0

    1

    -

    0

    1

    -

    合计

    57

    37

    4
, 百拇医药
    16

    64.19

    43

    14

    75.44

    2.2癌性胸水端粒酶活性检测与细胞学诊断结果比较

    在43例肺癌癌性胸水中,29例细胞学阳性胸水标本有27例端粒酶阳性,3例细胞学可疑胸水标本有2例端粒酶阳性,11例细胞学阴性胸水标本有4例端粒酶阳性;端粒酶活性检测和细胞学诊断总符合率为79.07%(34/43),二者联合阳性率可升至81.40%(35/43),见表2。

    表2 癌性胸水标本细胞学诊断与端粒酶活性检测结果比较 胸水来源

    细胞学
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    病例数

    端粒酶活性检测

    符合率(%)

    阳性

    阴性

    阳性率(%)

    肺癌

    +

    29

    27

    2

    93.10(27/29)

    可疑
, 百拇医药
    3

    2

    1

    66.67(2/3)

    -

    11

    4

    7

    36.36(4/11)

    79.07(34/43)

    其它肿瘤

    +

    8
, 百拇医药
    8

    0

    100(8/8)

    可疑

    1

    1

    0

    100(1/1)

    -

    5

    1

    4

    20(1/5)

, http://www.100md.com     85.71(12/14)

    在14例其它肿瘤的癌性胸水中,8例细胞学阳性胸水标本和1例细胞学可疑胸水标本端粒酶活性均为阳性,5例细胞学阴性胸水标本有1例端粒酶阳性;端粒酶活性检测和细胞学诊断总符合率为85.71%(12/14),见表2。

    3 讨论

    端粒酶是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白体,具有逆转录酶活性,能以自身RNA为模板从头合成端粒序列,以补偿细胞分裂时染色体端粒的缩短[3]。研究表明端粒酶激活是细胞癌变的早期事件,在肿瘤的发生发展过程中起重要作用[3]。迄今为止,在大多数人体肿瘤组织中均检测到了端粒酶活性,而在正常组织或良性肿瘤组织中多为阴性[4]。因此,国外学者认为端粒酶在肿瘤诊断中可能具有广泛应用价值。目前,国外已将端粒酶活性检测应用于尿液[5]、大肠冲洗液[6]、口腔漱洗液[7]、宫颈脱落细胞[8]及乳腺穿刺细胞标本[9]的肿瘤诊断研究,但对癌性胸水细胞端粒酶活性的研究尚未见报道。
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    胸水脱落细胞学检查是目前最常用的鉴别诊断方法,具有较高的特异性,但由于细胞学易受多种因素及读片经验影响,其敏感性一般在50%~70%之间[10],因而尚不能完全满足临床诊断的需要。在本文研究的57例癌性胸水中,细胞学敏感性为64.91%(37/57),这与文献报道基本一致。

    PCR-TRAP方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点,在标本中可检测到10~15个端粒酶阳性细胞的存在。作者采用该技术检测了57例癌性胸水,结果显示:43例肺癌胸水标本端粒酶活性检出率为76.74%(33/43);在14例其它肿瘤癌性胸水中端粒酶检出率为71.43%(10/14),其检出率高于细胞学检查。在肺癌及其它肿瘤胸水标本中,端粒酶活性检测与细胞学诊断符合率分别为79.07%(34/43)和85.71%(12/14)。细胞学阳性胸水标本端粒酶活性检出率肺癌为93.10%(27/29),其它肿瘤为100%(8/8)。如将端粒酶活性检测作为细胞学诊断的辅助手段,癌性胸水的诊断率可升至78.95%(45/57),提示端粒酶活性检测与细胞学检查有良好的一致性,联合应用能明显提高癌性胸水肿瘤细胞的检出率。
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    有人认为淋巴细胞和白细胞可低水平表达端粒酶活性[11]。因此,当标本中混有一定量的淋巴细胞和白细胞时,可能会干扰癌细胞端粒酶活性检测,影响结果判断。目前,我们正在收集炎性胸水及开展端粒酶活性定量测定研究,以期全面评价端粒酶活性高低与炎性胸水中淋巴细胞和白细胞的关系,以及炎性细胞影响癌性胸水端粒酶活性检测的可能性。

    初步研究结果表明,PCR-TRAP方法能有效检测胸水癌细胞中的端粒酶活性。这一结果提示:端粒酶活性检测技术是一种具有潜在应用价值的胸水癌细胞检测方法,有望成为癌性胸水诊断和鉴别诊断的一项指标,并日益受到研究人员的广泛关注。

    *本课题受中国医学科学院CMB院校长基金资助

    参考文献

    [1]Breslow RA, Shay JW, Gazdar AF, et al. Telomerase and early detection of cancer: a National cancer institute workshop. JNCI, 1997, 89:618
, http://www.100md.com
    [2]Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994, 266:2011

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    [4]Shay JW, Bacchetii S.A Survey of Telomerase Activity in Human Cancer. Eur J of Cancer, 1997, 33:787

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, 百拇医药
    [6]Yoshida K, Sugino T, Goodison S, et al. Detection of telomerase activity in exfoliated cancer cells in colonic luminal washings and its related clinical implication. Br J Cancer, 1997, 75:548

    [7]Califano J, Ahrendt SA, Meininger G, et al. Detection of telomerase activity in oral rinses from head and neck squamous cell carcinoma patients. Cancer Res, 1996, 56:5720

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    (收稿:1998-02-10修回:1998-07-22), http://www.100md.com