黄曲霉毒素相关性p53异常表达与肝细胞癌凋亡的关系
作者：马韵 邓卓霖 潘红波 韦义萍△ 李山
单位：广西医科大学病理教研室(南宁，530021) △附属护士学校
关键词：肝细胞癌；p53；凋亡；黄曲霉毒素
癌症990510 【摘 要】 目的：对黄曲霉毒素(Aflatoxin B1,AFB1)高污染区肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)p53异常表达与细胞凋亡的关系进行研究，探讨AFB1致肝癌的分子机制。方法：应用原位末端脱氧核糖核酰转移酶法和免疫组化SP法对56例HCC石蜡包埋组织进行染色，分析不同p53表达状态下HCC中细胞凋亡指数。结果：p53阳性组HCC的凋亡指数均数为3.81‰,p53阴性组为1.74‰，差别具有显著意义(P<0.05)。结论：AFB1相关性突变型p53蛋白具有刺激癌细胞增殖的作用，与之同时出现的细胞高凋亡率是细胞高增殖率的伴随现象，有助于增殖性高的优势克隆选择性增生。
, http://www.100md.com
中图分类号：R392.11 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)05-0524-03
The relationship between apoptosis and mutant p53 associated with aflatoxin B1 in human hepatocellular carcinoma
MA Yun,DENG Zhuo-lin,PAN Hong-bo,et al.
Department of Pathology,Guangxi Medical University,Nanning 530021,P.R. China
【Abstract】 Objective：To study the relationship between mutant p53 expression and apoptosis in hepatocellular carcinoma (HCC) from a high aflatoxin B1 contaminated area. Methods：Apoptotic cells and mutant p53 protein were detected by techniques of in situ terminal deoxynucleotide transferase labelling and immunohistochemical S-P method in 56 paraffin-embedded tissues of HCC. Results：Apoptotic index was 3.81‰ in the HCC with positive expression of mutant p53, this was significant higher than that of 1.74‰ in mutant p53 negative cases (P<0.05). Conclusions：The mutant p53 protein which is associated with aflatoxin B1 may stimulate malignant cell proliferation,meanwhile a higher apoptotic rate is the associated phenomenon of high proliferation rate, is contributory to selective proliferation of those clone with higher proliferative ability.
, 百拇医药
Key words：Hepatocellular carcinomas；p53 Apoptosis; Aflatoxin B1
细胞凋亡与肿瘤的发生、发展有密切的关系，有多种基因参与其调节。其中引起众多研究者高度兴趣的是p53基因。野生型p53基因在诱导细胞凋亡中的作用已经得到公认，但突变型p53则视其突变位点及空间构像的不同，并不一定丧失调节凋亡的能力〔1〕。不同原因所引起的p53基因突变及其与凋亡的关系，仍值得进一步研究。本文应用原位末端脱氧核糖核酰转移酶(In Situ Terminal Deoxynucleotide Transferase,ISTdT)法和免疫组化SP法，检测肝细胞癌中凋亡细胞和p53的表达，旨在探讨黄曲霉毒素相关性突变型p53表达与肝细胞癌凋亡的关系。
1 材料与方法
1.1 标本
, 百拇医药
收集黄曲霉毒素高污染区肝癌标本56例，所有组织均经10%福尔马林固定、石蜡包埋，5μm连续切片。
1.2 试剂
原位凋亡检测试剂盒(Oncor.公司,ApopTag-PeroxidaseKit,S7100-Kit)，抗p53单克隆抗体(Oncor.Pab-240)，SP试剂盒(MAXIM)等。
1.3 ISTdT法检测细胞凋亡
按试剂盒说明操作略述如下：切片脱蜡至水→20mg/L-1PK消化→2%H2O2甲醇5min→平衡液室温孵育→TdT酶工作液37℃温育1h→终止/清洗缓冲液→过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,37℃温育30min→DAB显色。阳性物质棕褐色，位于细胞核内。凋亡细胞计数在高倍视野下进行，视组织大小每例计4000～8000个癌细胞中的凋亡细胞及凋亡小体总数，凋亡指数(ApoptoticIndex,AI)=(凋亡细胞数+凋亡小体数)/1000受检细胞。
, 百拇医药
1.4 p53蛋白免疫组化染色
微波抗原修复后，按常规进行SP法染色。阳性物质位于癌细胞核内，以5%以上癌细胞核出现阳性染色物质视为阳性标准。
1.5 统计学处理
用华西医科大学医学统计软件对p53阳性和阴性组病例的AI均数进行校正t检验。
2 结果
2.1 细胞凋亡在HCC中的形态及分布
ISTdT染色呈棕褐色的细胞在HE染色切片中有明显的凋亡形态表现：凋亡细胞与周围细胞失去连接，呈游离状或脱落在血窦内，体积变小，胞浆嗜酸性，核固缩浓染等(图1-2)；癌组织中的凋亡细胞多呈散在分布。AI范围为0.1‰-15.9‰。
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图1 肝细胞癌组织中的凋亡细胞(箭
头所示，HE染色，400×)
图2 肝细胞癌中的凋亡细胞(图中
央棕褐色者，ISTdT法200×)
2.2 p53蛋白在HCC中的表达及与AI的关系
p53蛋白在本组HCC中的阳性率为50%(28/56例)；癌旁肝组织中除少数病例肝细胞浆内有明显的异质性表达外，肝细胞核内未见确切的阳性反应。p53阳性的HCC中，AI均数高于p53阴性的HCC，差别具有显著意义(P<0.05)，见表1。
表1突变型p53表达与HCC细胞凋亡指数 p53表达
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例数
凋亡指数(
)
t值
P
阳 性
28
3.81±3.53
2.93
<0.05
阴 性
28
1.74±1.24
, 百拇医药
3 讨论
我们前期在广西AFB1高污染区，用限制性片段长度多态性分析法检测52例HCC中p53基因249密码子，发现突变率高达69%〔2〕，且突变与HCC中p53表达有显著相关性。又经DNA测序证实在该地区HCC中集中发生p53249密码子的AGG→AGT突变〔3〕。因此我们认为在AFB1高污染区，HCC中的p53蛋白主要是突变型(黄曲霉毒素相关性)而非野生型p53蛋白的过表达。本地肝细胞癌中AI与p53的异常表达存在正相关性，此结果亦见于Zhao的同类研究中〔4〕。这种结果显然有违于我们熟知的突变型p53难以诱导凋亡发生的理论。
细胞凋亡是一种细胞生理性死亡形式，有多种因素可诱导其发生，如细胞外环境变化以及基因突变等。在正常肝中，凋亡发生率极低〔5〕，而当某些因素引起肝细胞增殖率升高时，往往也同时出现凋亡率的增加〔6〕。动物实验结果表明，在肝细胞癌变过程中，细胞凋亡率与增殖率同步增加，但凋亡率始终明显低于增殖率〔7〕。在此种情况下，凋亡的发生清除了生长缓慢的细胞亚克隆(如分化高的细胞)，而使增殖性强的优势克隆得以选择性生长。众多研究业以显示突变型p53蛋白具有癌蛋白活性，可刺激癌细胞增殖，p53蛋白与增殖细胞核抗原在HCC中的表达呈一致性〔8〕。AFB1作为一强力基因毒性致癌物，可以引起p53特异点突变，在HCC的发生中具有重要意义。我们认为，AFB1相关性突变型p53蛋白在肝癌发生中主要起刺激细胞增殖的作用，而较高的凋亡率并非意味着这种突变型p53具有诱导凋亡的潜能，而是伴随着细胞高增殖同步发生的，其意义是使生长滞后的细胞自动退出癌症舞台，起到了优化增殖性强的癌细胞单克隆生长的作用。从此种意义上说，癌组织中发生凋亡是一把双刃剑，并不总是有利于机体。
, 百拇医药
基金项目：本论文由国家自然科学基金(39860032)和广西教育厅重点资助项目资金(98-2-8)资助
〔参考文献〕
〔1〕 Li B,Greenberg N,Stephens LC,et al. Preferential overexpression of a 172 Arg-Leu mutant p53 in the mammary gland of transgenic mice results in altered lobuloalveolar development〔J〕. Cell Growth Differ,1994,5(7)：711～721.
〔2〕 马韵，邓卓霖，罗虹，等.黄曲霉毒素高污染区肝细胞癌p53基因高频率定点突变〔J〕.广西科学，1996，3(3)：48～50.
〔3〕 邓卓霖，潘郎星，马韵，等.广西黄曲霉毒素高危区肝癌p53基因序列改变〔J〕.中华肿瘤杂志，1997，19(1)：18～21.
, 百拇医药
〔4〕 Zhao M,Zimmermann A. Apoptosis in human hepatocellular carcinoma and in liver cell dysplasia is correlated with p53 protein immunoreactivity〔J〕. J Clin Pathol，1997，50(5)：394～ 400.
〔5〕 Bursch W,Lauer B,Timmermann-Trosiener I,et al. Controlled death (apoptosis) of normal and putative preneoplastic cells in rat liver following withdrawal of tumor promoters〔J〕. Carcinogenesis，1984，5(4)：453～458
〔6〕 Colwmbano A,Ledda-Columbano GM,Coni PP,et al. Occurrence of cell death (apoptosis) during the involution of liver hyperplasia〔J〕. Lab Invest,1985,52(6)：670～ 675.
〔7〕 Grasl-Kraupp B,Ruttkay-Nedecky B,Mullauer L,et al. Inherent increase of apoptosis in liver tumors：implications for carcinogenesis and tumor regression〔J〕. Hepatology,1997,25(4)：906～912.
〔8〕 郑亚新,余业勤,刘康达，等.肝细胞癌形成门静脉癌栓与p53、PCNA表达的关系〔J〕.中华消化杂志,1996,16(2)：75～78.
收稿日期：1998-12-18；修回日期：1999-01-25, 百拇医药
单位：广西医科大学病理教研室(南宁，530021) △附属护士学校
关键词：肝细胞癌；p53；凋亡；黄曲霉毒素
癌症990510 【摘 要】 目的：对黄曲霉毒素(Aflatoxin B1,AFB1)高污染区肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)p53异常表达与细胞凋亡的关系进行研究，探讨AFB1致肝癌的分子机制。方法：应用原位末端脱氧核糖核酰转移酶法和免疫组化SP法对56例HCC石蜡包埋组织进行染色，分析不同p53表达状态下HCC中细胞凋亡指数。结果：p53阳性组HCC的凋亡指数均数为3.81‰,p53阴性组为1.74‰，差别具有显著意义(P<0.05)。结论：AFB1相关性突变型p53蛋白具有刺激癌细胞增殖的作用，与之同时出现的细胞高凋亡率是细胞高增殖率的伴随现象，有助于增殖性高的优势克隆选择性增生。
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中图分类号：R392.11 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)05-0524-03
The relationship between apoptosis and mutant p53 associated with aflatoxin B1 in human hepatocellular carcinoma
MA Yun,DENG Zhuo-lin,PAN Hong-bo,et al.
Department of Pathology,Guangxi Medical University,Nanning 530021,P.R. China
【Abstract】 Objective：To study the relationship between mutant p53 expression and apoptosis in hepatocellular carcinoma (HCC) from a high aflatoxin B1 contaminated area. Methods：Apoptotic cells and mutant p53 protein were detected by techniques of in situ terminal deoxynucleotide transferase labelling and immunohistochemical S-P method in 56 paraffin-embedded tissues of HCC. Results：Apoptotic index was 3.81‰ in the HCC with positive expression of mutant p53, this was significant higher than that of 1.74‰ in mutant p53 negative cases (P<0.05). Conclusions：The mutant p53 protein which is associated with aflatoxin B1 may stimulate malignant cell proliferation,meanwhile a higher apoptotic rate is the associated phenomenon of high proliferation rate, is contributory to selective proliferation of those clone with higher proliferative ability.
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Key words：Hepatocellular carcinomas；p53 Apoptosis; Aflatoxin B1
细胞凋亡与肿瘤的发生、发展有密切的关系，有多种基因参与其调节。其中引起众多研究者高度兴趣的是p53基因。野生型p53基因在诱导细胞凋亡中的作用已经得到公认，但突变型p53则视其突变位点及空间构像的不同，并不一定丧失调节凋亡的能力〔1〕。不同原因所引起的p53基因突变及其与凋亡的关系，仍值得进一步研究。本文应用原位末端脱氧核糖核酰转移酶(In Situ Terminal Deoxynucleotide Transferase,ISTdT)法和免疫组化SP法，检测肝细胞癌中凋亡细胞和p53的表达，旨在探讨黄曲霉毒素相关性突变型p53表达与肝细胞癌凋亡的关系。
1 材料与方法
1.1 标本
, 百拇医药
收集黄曲霉毒素高污染区肝癌标本56例，所有组织均经10%福尔马林固定、石蜡包埋，5μm连续切片。
1.2 试剂
原位凋亡检测试剂盒(Oncor.公司,ApopTag-PeroxidaseKit,S7100-Kit)，抗p53单克隆抗体(Oncor.Pab-240)，SP试剂盒(MAXIM)等。
1.3 ISTdT法检测细胞凋亡
按试剂盒说明操作略述如下：切片脱蜡至水→20mg/L-1PK消化→2%H2O2甲醇5min→平衡液室温孵育→TdT酶工作液37℃温育1h→终止/清洗缓冲液→过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,37℃温育30min→DAB显色。阳性物质棕褐色，位于细胞核内。凋亡细胞计数在高倍视野下进行，视组织大小每例计4000～8000个癌细胞中的凋亡细胞及凋亡小体总数，凋亡指数(ApoptoticIndex,AI)=(凋亡细胞数+凋亡小体数)/1000受检细胞。
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1.4 p53蛋白免疫组化染色
微波抗原修复后，按常规进行SP法染色。阳性物质位于癌细胞核内，以5%以上癌细胞核出现阳性染色物质视为阳性标准。
1.5 统计学处理
用华西医科大学医学统计软件对p53阳性和阴性组病例的AI均数进行校正t检验。
2 结果
2.1 细胞凋亡在HCC中的形态及分布
ISTdT染色呈棕褐色的细胞在HE染色切片中有明显的凋亡形态表现：凋亡细胞与周围细胞失去连接，呈游离状或脱落在血窦内，体积变小，胞浆嗜酸性，核固缩浓染等(图1-2)；癌组织中的凋亡细胞多呈散在分布。AI范围为0.1‰-15.9‰。
, http://www.100md.com
图1 肝细胞癌组织中的凋亡细胞(箭
头所示，HE染色，400×)
图2 肝细胞癌中的凋亡细胞(图中
央棕褐色者，ISTdT法200×)
2.2 p53蛋白在HCC中的表达及与AI的关系
p53蛋白在本组HCC中的阳性率为50%(28/56例)；癌旁肝组织中除少数病例肝细胞浆内有明显的异质性表达外，肝细胞核内未见确切的阳性反应。p53阳性的HCC中，AI均数高于p53阴性的HCC，差别具有显著意义(P<0.05)，见表1。
表1突变型p53表达与HCC细胞凋亡指数 p53表达
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例数
凋亡指数(
)t值
P
阳 性
28
3.81±3.53
2.93
<0.05
阴 性
28
1.74±1.24
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3 讨论
我们前期在广西AFB1高污染区，用限制性片段长度多态性分析法检测52例HCC中p53基因249密码子，发现突变率高达69%〔2〕，且突变与HCC中p53表达有显著相关性。又经DNA测序证实在该地区HCC中集中发生p53249密码子的AGG→AGT突变〔3〕。因此我们认为在AFB1高污染区，HCC中的p53蛋白主要是突变型(黄曲霉毒素相关性)而非野生型p53蛋白的过表达。本地肝细胞癌中AI与p53的异常表达存在正相关性，此结果亦见于Zhao的同类研究中〔4〕。这种结果显然有违于我们熟知的突变型p53难以诱导凋亡发生的理论。
细胞凋亡是一种细胞生理性死亡形式，有多种因素可诱导其发生，如细胞外环境变化以及基因突变等。在正常肝中，凋亡发生率极低〔5〕，而当某些因素引起肝细胞增殖率升高时，往往也同时出现凋亡率的增加〔6〕。动物实验结果表明，在肝细胞癌变过程中，细胞凋亡率与增殖率同步增加，但凋亡率始终明显低于增殖率〔7〕。在此种情况下，凋亡的发生清除了生长缓慢的细胞亚克隆(如分化高的细胞)，而使增殖性强的优势克隆得以选择性生长。众多研究业以显示突变型p53蛋白具有癌蛋白活性，可刺激癌细胞增殖，p53蛋白与增殖细胞核抗原在HCC中的表达呈一致性〔8〕。AFB1作为一强力基因毒性致癌物，可以引起p53特异点突变，在HCC的发生中具有重要意义。我们认为，AFB1相关性突变型p53蛋白在肝癌发生中主要起刺激细胞增殖的作用，而较高的凋亡率并非意味着这种突变型p53具有诱导凋亡的潜能，而是伴随着细胞高增殖同步发生的，其意义是使生长滞后的细胞自动退出癌症舞台，起到了优化增殖性强的癌细胞单克隆生长的作用。从此种意义上说，癌组织中发生凋亡是一把双刃剑，并不总是有利于机体。
, 百拇医药
基金项目：本论文由国家自然科学基金(39860032)和广西教育厅重点资助项目资金(98-2-8)资助
〔参考文献〕
〔1〕 Li B,Greenberg N,Stephens LC,et al. Preferential overexpression of a 172 Arg-Leu mutant p53 in the mammary gland of transgenic mice results in altered lobuloalveolar development〔J〕. Cell Growth Differ,1994,5(7)：711～721.
〔2〕 马韵，邓卓霖，罗虹，等.黄曲霉毒素高污染区肝细胞癌p53基因高频率定点突变〔J〕.广西科学，1996，3(3)：48～50.
〔3〕 邓卓霖，潘郎星，马韵，等.广西黄曲霉毒素高危区肝癌p53基因序列改变〔J〕.中华肿瘤杂志，1997，19(1)：18～21.
, 百拇医药
〔4〕 Zhao M,Zimmermann A. Apoptosis in human hepatocellular carcinoma and in liver cell dysplasia is correlated with p53 protein immunoreactivity〔J〕. J Clin Pathol，1997，50(5)：394～ 400.
〔5〕 Bursch W,Lauer B,Timmermann-Trosiener I,et al. Controlled death (apoptosis) of normal and putative preneoplastic cells in rat liver following withdrawal of tumor promoters〔J〕. Carcinogenesis，1984，5(4)：453～458
〔6〕 Colwmbano A,Ledda-Columbano GM,Coni PP,et al. Occurrence of cell death (apoptosis) during the involution of liver hyperplasia〔J〕. Lab Invest,1985,52(6)：670～ 675.
〔7〕 Grasl-Kraupp B,Ruttkay-Nedecky B,Mullauer L,et al. Inherent increase of apoptosis in liver tumors：implications for carcinogenesis and tumor regression〔J〕. Hepatology,1997,25(4)：906～912.
〔8〕 郑亚新,余业勤,刘康达，等.肝细胞癌形成门静脉癌栓与p53、PCNA表达的关系〔J〕.中华消化杂志,1996,16(2)：75～78.
收稿日期：1998-12-18；修回日期：1999-01-25, 百拇医药