寡脱氧核苷酸抑制N-ras癌基因表达及肝癌细胞增殖的实验研究
作者：杨林 张定凤 王玉芝 王升启 任红 朱宝珍
单位：杨林 任红 张定凤(重庆医科大学病毒性肝炎研究所，重庆400010)；王玉芝 王升启 朱宝珍(中国军事医学科学院放射医学研究所，北京100850)
关键词：肝肿瘤；N-ras癌基因；三螺旋形成寡脱氧核苷酸；反义寡脱氧核苷酸
癌症000606
【摘要】目的：了解三螺旋形成寡核苷酸(TFO)、反义寡核苷酸(ODNas)抑制肝癌细胞生长的作用。方法：以N-ras第二转录起始位点及翻译起始区1～6密码为靶点，合成12聚硫代磷酸TFO(TFO12)、19聚硫代磷酸ODNas(ODNas19)，同时合成19聚无关序列硫代磷酸寡核苷酸对照(ODNcon)。在人肝癌Bel7402细胞观察了硫代磷酸寡核苷酸对N-ras表达p21蛋白的抑制及对细胞增殖的影响。结果：TFO12、ODNas19处理的细胞p21合成降低了80.2%、67.5%；细胞增殖降低了88%、77%；3H-TdR掺入降低了78.2%、69.5%。TFO12、ODNas19的生长抑制作用呈剂量依赖性，该作用在处理后6小时即可检出，12小时达高峰，以后逐渐降低，但72小时后仍有一定作用。两者联合应用抑制作用增强。ODNcon对N-ras表达p21及细胞增殖无影响。结论：针对N-ras不同基因区的TFO、ODNas能有效抑制ras表达及ras相关性肝癌细胞的增殖，具有潜在应用价值。
, 百拇医药
中图分类号：R735.7 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)06-0527-03
Inhibitory effect of oligodeoxynucleotides on expression of N-ras and
proliferation of human hepatocellular carcinoma Bel 7402 cell lines
YANG Lin， ZHANG Ding-feng， WANG Yu-zhi， et al.
(Institute for Viral Hepatitis， Chongqing University of Medical Sciences， Chongqing 400010， P.R.China)
, http://www.100md.com
(Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,P.R.China)
【 Abstract】 Objective： To evaluate effect of triplex forming oligodeoxynucleotides (TFO) and antisense oligodeoxynucleotides (ODNas) on proliferation of human hepatocellular carcinoma cells. Methods： A 12 mer phospho-rothioate TFO (TFO12) directed at the second transcriotion start site of N-ras gene and a 19 mer phosphorothioate ODNas (ODNas19) complementary to translation initiation codon and downstream 5 codons of N-ras mRNA were synthesized. A 19 mer unrelated phosphorothioate TFO(ODNcon) was olso synthesized and used as control effect of TFO12 and ODNas19 on synthesis of p21 and proliferation of human hepatocellular carcinoma Bel 7402 cells were examined. Results： TFO12 and ODNas19 reduced synthesis of p21 by 80.2% and 67.5% ， respectively. At concentration of 16μ mol/L， TFO12 and ODNas21 inhibited proliferation of Bel 7402 cells by 88% and 77% ， respectively. In the Bel 7402 cells treated with TFO12 and ODNas19，3H-thymidine incorporation was decreased 78.2% and 69.5% respectively. The growth inhibitions of TFO12 and ODNas19 were dose-dependent， and were observed at 6 hour after administration， reached the highest point at 12 hour. The mixture of TFO12 and ODNas19 was more effective than TFO12 or ODNas19 alone. No inhibitions were observed in ODNcon group. Conclusion： Triplex forming oligodeoxynucleotides and antisense oligodeoxynucleotides were both potential inhibitor for expression of N-ras and proliferation of hepatocellular carcinoma cells.
, http://www.100md.com
Key words： Liver neoplasms; N-ras oncogene;Triplex forming oligodeoxynucleotides; Antisense
oligodeoxynucleotides
Ras癌基因在肝癌发生中起重要作用，阻断N-ras表达可能抑制肝癌细胞增殖。三螺旋形成寡核苷酸(triplex forming oligodeoxynucleotides TFO)及反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides ODNas)技术是近年发展起来的调控基因表达的重要手段，前者作用于转录水平，后者作用于翻译水平。文献报道两者在体外能抑制癌基因表达及癌细胞生长[1～5]。然而，TFO能否抑制ras表达及肝癌细胞的增殖，尚未见报道。已明确未经修饰的寡核苷酸在细胞内易被核酸酶降解、稳定性差，而硫代磷酸修饰能增强寡核苷酸对核酸酶的抵抗性。因此，本文在体外细胞系统观察了针对N-ras基因的硫代磷酸TFO、硫代磷酸ODNas对N-ras表达及肝癌细胞增殖的影响。
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图1 TFO12、ODNas19对Bel7402细胞增殖的抑制动态曲线
图2 TFO12、ODNas19对Bel7402细胞3H-TdR掺入的抑制
图3 TFO12、ODNas19对Be17402细胞增殖的剂量依赖性抑制
1 材料与方法
1.1 硫代磷酸TFO12、ODNas19合成
12聚硫代磷酸TFO(TFO12)的靶点为N-ras基因第二转录起始点及下游含GGGCGG盒的区域(-240nt～-228nt)，序列为3'GGGAGGGGCGGG5'；19聚硫代磷酸ODNas(ODNas19)与N-rasmRNA翻译起始码及下游5个密码互补，序列为3'TACTGACTCATGTTTGACC5'。19聚无关序列硫代磷酸寡核苷酸对照(ODNcon)为3'ACGCTTTGTTACAGTCTAC5'。所有硫代磷酸寡核苷酸均在美国ABI公司391PCRmateDNA自动合成仪上合成并用高效薄层色谱法纯化。
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1.2 Bel7402肝癌细胞培养
人肝癌Bel7402细胞株(军事医学科学院周淑珍研究员惠赠)有N-ras高表达p21[6]。用含10%小牛血清的RPMI1640(Sigma)培养基按常规方法培养。
1.3 TFO12、ODNas19对Bel7402细胞增殖影响的检测
1.3.1细胞生长抑制试验：将细胞以5×104个/孔接种于24孔培养板，同时加入不同浓度寡核苷酸孵育，在不同时间每浓度组分别取3孔计数细胞，计算生长抑制率。
细胞生长抑制率=(Nn-N)/(Nn-No)×100%
式中Nn、N分别为空白对照组、实验组n小时后细胞计数，No为初始细胞计数。
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1.3.2 3H-TdR掺入试验：7402细胞以1×105个/孔接种于96板培养过夜，加入16μmol/L寡核苷酸，然后进行3H-TdR掺入试验。
1.4 7402细胞内p21蛋白检测
ABC-ELISA法[5]检测7402细胞内p21蛋白，所用polylysine为Sigma产品，鼠抗p21单抗为军事医学科学院产品。
2 结果
2.1 TFO12、ODNas19对7402细胞增殖的抑制
TFO12、ODNas19对细胞增殖有明显抑制作用，该作用在处理后6小时出现，12小时达高峰，以后逐渐下降，但72小时后仍有一定作用(图1)。两者联合应用作用更强。3H-TdR结果与细胞计数结果基本一致，TFO12、ODNas19作用12小时后，3H-TdR掺入降低了78.2%、60.5%(图2)。ODNcon对细胞增殖无影响。
, 百拇医药
2.2 TFO12、ODNas19的剂量依赖性抑制
TFO12、ODNas19对7402细胞生长的抑制呈剂量依赖性，在0～25μmol/L范围内，抑制作用与剂量呈正相关，当浓度大于25μmol/L后，加大浓度，抑制作用并不随之上升而呈平台效应(图3)。
2.3 TFO12、ODNas19对p21蛋白合成的抑制
TFO12、ODNas19处理细胞12小时后，细胞内p21明显低于对照组，两者联合应用的抑制更强(表1)。ODNcon对p21合成无影响。
表1 TF012、ODNas 19对Bel 7402细胞内P21蛋白合成的抑制 组别
P21
(OD492)值，(
±s)
, 百拇医药
抑制率(%)
TFO12组
0.26±0.02*
80.2
ODNas19组
0.40±0.01*
67.5
联合应用组
0.15±0.01*
88.6
ODNcon组
, 百拇医药 1.29±0.02**
3.4
空白对照组
1.32±0.03
t检验n=3*P<0.01;**p>0.5
3 讨论
三螺旋形成寡核苷酸(TFO)能与含同聚嘌呤(嘧啶序列)的双螺旋DNA形成三螺旋结构而抑制基因转录[1～3]，是一种基因治疗的新方法。Ras是一种重要的癌基因，文献报道70%～80%的HCC有N-ras高表达；肝癌细胞DNA中高表达的N-ras能使NIH/3T3细胞发生转化[6～8]，可见N-ras过量或异常表达的p21可能是肝癌形成的分子基础，阻断N-ras表达，可能抑制肝癌细胞增殖。N-ras启动子第二转录起始点下游含一个GGGGCGG盒的区域是N-ras启动子重要调控区，该区域又具有形成三螺旋结构特点[9，10]。因此，本文选择该区域及N-rasmRNA起始区为靶点进行TFO、ODNas抗肝癌细胞增殖的研究，尚未见类似的研究报道。
, 百拇医药
由于寡核苷酸在细胞内易被核酸酶降解、稳定性差，因此，本文合成了硫代修饰的硫代磷酸TFO、ODNas。实验表明TFO12、ODNas19能特异性抑制N-ras表达及Bel7402肝癌细胞增殖，其抑制与作用时间有关，并具有剂量依赖性。两者联合应用抑制作用增强，可能因联合应用时N-ras的表达在转录水平和翻译水平受到双重阻断。该结果说明不同功能区的三螺旋寡核苷酸或反义寡核苷酸联合应用可能提高对靶基因的抑制效果。
TFO12对p21合成、细胞增殖的抑制作用(88%、80.2%)强于ODNas19(77%、67.5%)，可能因TFO12作用于基因调控区及转录起始区，直接抑制转录之故。该结果提示基因调控区可能是基因阻断疗法的更佳靶位，值得进一步研究。
N-ras表达降低时，7402肝癌细胞生长受到抑制，而对N-ras表达无影响的无关序列硫代磷酸寡核苷酸对肝癌细胞生长也无作用，该结果进一步提示N-ras与肝细胞癌变有着内在的联系、激活的N-ras在肝癌发生以及维持其表型中起着重要作用。
, 百拇医药
[参考文献]
1，Moffat AS. Triplex DNA finally Comes of age [J]. Science， 1991， 252： 1374.
2，Postel EH， Flint SJ， Kessler DJ， et al. Evidence that a triplex- forming oligodeoxyribonucleotide binds to the c- myc promoter in HeLa cells， thereby reducing c- myc [J]. Proc Natl Acad Sci USA 1991， 88： 8227.
3，Kim HG， Miller DM. A novel triplex- forming oligonucleotide targeted to human cyclin D1 (bcl- 1， proto- oncogene) promoter inhibits transcription in HeLa cells [J]. Biochemistry， 1998， 37(8)： 2666.
, 百拇医药
4，Redner RR， Nienhuis AW. An oligomer complementary to c- myc mRNA inhibit proliferation of HL- 60 promyelocytic cells and induces differentiation [J]. Molecular and Cellular Biology， 1988， 8(2)： 963.
5，许毅，邓国仁，梁亚云，等.反义C-Ha-ras寡聚核苷酸对转化细胞的生长抑制及其p21蛋白合成的抑制[J].中国科学(B辑)，1990，1：64.
6，顾健人，田培坤，王翔，等.人原发性肝癌及7402细胞株和髓细胞白血病细胞株(K562)的癌基因(转化基因)的共同属性N-ras基因[J].中国科学(B辑)，1985，5：452.
7，顾健人.人原发性肝癌的癌基因和抗癌基因的研究进展[J].肝脏，1992，1(1)：109.
, http://www.100md.com
8，顾健人，胡利富，万大方，等.人原发性肝癌转化基因N-ras的研究[J].肿瘤，1985，5(2)：5210.
9，Hall A， Brown R. Human N- ras： cDNA cloning and gene structure [J]. Nucleic Acids Research， 1985， 13(14)： 5255.
10Thorn JT， Todd AV， Warrilow D， et al. Characterization of the human N- ras promoter region [J]. Oncogene， 1991， 6： 1843.
收稿日期：1999-07-16;修回日期：1999-09-14, http://www.100md.com
单位：杨林 任红 张定凤(重庆医科大学病毒性肝炎研究所，重庆400010)；王玉芝 王升启 朱宝珍(中国军事医学科学院放射医学研究所，北京100850)
关键词：肝肿瘤；N-ras癌基因；三螺旋形成寡脱氧核苷酸；反义寡脱氧核苷酸
癌症000606
【摘要】目的：了解三螺旋形成寡核苷酸(TFO)、反义寡核苷酸(ODNas)抑制肝癌细胞生长的作用。方法：以N-ras第二转录起始位点及翻译起始区1～6密码为靶点，合成12聚硫代磷酸TFO(TFO12)、19聚硫代磷酸ODNas(ODNas19)，同时合成19聚无关序列硫代磷酸寡核苷酸对照(ODNcon)。在人肝癌Bel7402细胞观察了硫代磷酸寡核苷酸对N-ras表达p21蛋白的抑制及对细胞增殖的影响。结果：TFO12、ODNas19处理的细胞p21合成降低了80.2%、67.5%；细胞增殖降低了88%、77%；3H-TdR掺入降低了78.2%、69.5%。TFO12、ODNas19的生长抑制作用呈剂量依赖性，该作用在处理后6小时即可检出，12小时达高峰，以后逐渐降低，但72小时后仍有一定作用。两者联合应用抑制作用增强。ODNcon对N-ras表达p21及细胞增殖无影响。结论：针对N-ras不同基因区的TFO、ODNas能有效抑制ras表达及ras相关性肝癌细胞的增殖，具有潜在应用价值。
, 百拇医药
中图分类号：R735.7 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)06-0527-03
Inhibitory effect of oligodeoxynucleotides on expression of N-ras and
proliferation of human hepatocellular carcinoma Bel 7402 cell lines
YANG Lin， ZHANG Ding-feng， WANG Yu-zhi， et al.
(Institute for Viral Hepatitis， Chongqing University of Medical Sciences， Chongqing 400010， P.R.China)
, http://www.100md.com
(Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,P.R.China)
【 Abstract】 Objective： To evaluate effect of triplex forming oligodeoxynucleotides (TFO) and antisense oligodeoxynucleotides (ODNas) on proliferation of human hepatocellular carcinoma cells. Methods： A 12 mer phospho-rothioate TFO (TFO12) directed at the second transcriotion start site of N-ras gene and a 19 mer phosphorothioate ODNas (ODNas19) complementary to translation initiation codon and downstream 5 codons of N-ras mRNA were synthesized. A 19 mer unrelated phosphorothioate TFO(ODNcon) was olso synthesized and used as control effect of TFO12 and ODNas19 on synthesis of p21 and proliferation of human hepatocellular carcinoma Bel 7402 cells were examined. Results： TFO12 and ODNas19 reduced synthesis of p21 by 80.2% and 67.5% ， respectively. At concentration of 16μ mol/L， TFO12 and ODNas21 inhibited proliferation of Bel 7402 cells by 88% and 77% ， respectively. In the Bel 7402 cells treated with TFO12 and ODNas19，3H-thymidine incorporation was decreased 78.2% and 69.5% respectively. The growth inhibitions of TFO12 and ODNas19 were dose-dependent， and were observed at 6 hour after administration， reached the highest point at 12 hour. The mixture of TFO12 and ODNas19 was more effective than TFO12 or ODNas19 alone. No inhibitions were observed in ODNcon group. Conclusion： Triplex forming oligodeoxynucleotides and antisense oligodeoxynucleotides were both potential inhibitor for expression of N-ras and proliferation of hepatocellular carcinoma cells.
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Key words： Liver neoplasms; N-ras oncogene;Triplex forming oligodeoxynucleotides; Antisense
oligodeoxynucleotides
Ras癌基因在肝癌发生中起重要作用，阻断N-ras表达可能抑制肝癌细胞增殖。三螺旋形成寡核苷酸(triplex forming oligodeoxynucleotides TFO)及反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides ODNas)技术是近年发展起来的调控基因表达的重要手段，前者作用于转录水平，后者作用于翻译水平。文献报道两者在体外能抑制癌基因表达及癌细胞生长[1～5]。然而，TFO能否抑制ras表达及肝癌细胞的增殖，尚未见报道。已明确未经修饰的寡核苷酸在细胞内易被核酸酶降解、稳定性差，而硫代磷酸修饰能增强寡核苷酸对核酸酶的抵抗性。因此，本文在体外细胞系统观察了针对N-ras基因的硫代磷酸TFO、硫代磷酸ODNas对N-ras表达及肝癌细胞增殖的影响。
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图1 TFO12、ODNas19对Bel7402细胞增殖的抑制动态曲线
图2 TFO12、ODNas19对Bel7402细胞3H-TdR掺入的抑制
图3 TFO12、ODNas19对Be17402细胞增殖的剂量依赖性抑制
1 材料与方法
1.1 硫代磷酸TFO12、ODNas19合成
12聚硫代磷酸TFO(TFO12)的靶点为N-ras基因第二转录起始点及下游含GGGCGG盒的区域(-240nt～-228nt)，序列为3'GGGAGGGGCGGG5'；19聚硫代磷酸ODNas(ODNas19)与N-rasmRNA翻译起始码及下游5个密码互补，序列为3'TACTGACTCATGTTTGACC5'。19聚无关序列硫代磷酸寡核苷酸对照(ODNcon)为3'ACGCTTTGTTACAGTCTAC5'。所有硫代磷酸寡核苷酸均在美国ABI公司391PCRmateDNA自动合成仪上合成并用高效薄层色谱法纯化。
, http://www.100md.com
1.2 Bel7402肝癌细胞培养
人肝癌Bel7402细胞株(军事医学科学院周淑珍研究员惠赠)有N-ras高表达p21[6]。用含10%小牛血清的RPMI1640(Sigma)培养基按常规方法培养。
1.3 TFO12、ODNas19对Bel7402细胞增殖影响的检测
1.3.1细胞生长抑制试验：将细胞以5×104个/孔接种于24孔培养板，同时加入不同浓度寡核苷酸孵育，在不同时间每浓度组分别取3孔计数细胞，计算生长抑制率。
细胞生长抑制率=(Nn-N)/(Nn-No)×100%
式中Nn、N分别为空白对照组、实验组n小时后细胞计数，No为初始细胞计数。
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1.3.2 3H-TdR掺入试验：7402细胞以1×105个/孔接种于96板培养过夜，加入16μmol/L寡核苷酸，然后进行3H-TdR掺入试验。
1.4 7402细胞内p21蛋白检测
ABC-ELISA法[5]检测7402细胞内p21蛋白，所用polylysine为Sigma产品，鼠抗p21单抗为军事医学科学院产品。
2 结果
2.1 TFO12、ODNas19对7402细胞增殖的抑制
TFO12、ODNas19对细胞增殖有明显抑制作用，该作用在处理后6小时出现，12小时达高峰，以后逐渐下降，但72小时后仍有一定作用(图1)。两者联合应用作用更强。3H-TdR结果与细胞计数结果基本一致，TFO12、ODNas19作用12小时后，3H-TdR掺入降低了78.2%、60.5%(图2)。ODNcon对细胞增殖无影响。
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2.2 TFO12、ODNas19的剂量依赖性抑制
TFO12、ODNas19对7402细胞生长的抑制呈剂量依赖性，在0～25μmol/L范围内，抑制作用与剂量呈正相关，当浓度大于25μmol/L后，加大浓度，抑制作用并不随之上升而呈平台效应(图3)。
2.3 TFO12、ODNas19对p21蛋白合成的抑制
TFO12、ODNas19处理细胞12小时后，细胞内p21明显低于对照组，两者联合应用的抑制更强(表1)。ODNcon对p21合成无影响。
表1 TF012、ODNas 19对Bel 7402细胞内P21蛋白合成的抑制 组别
P21
(OD492)值，(
±s), 百拇医药
抑制率(%)
TFO12组
0.26±0.02*
80.2
ODNas19组
0.40±0.01*
67.5
联合应用组
0.15±0.01*
88.6
ODNcon组
, 百拇医药 1.29±0.02**
3.4
空白对照组
1.32±0.03
t检验n=3*P<0.01;**p>0.5
3 讨论
三螺旋形成寡核苷酸(TFO)能与含同聚嘌呤(嘧啶序列)的双螺旋DNA形成三螺旋结构而抑制基因转录[1～3]，是一种基因治疗的新方法。Ras是一种重要的癌基因，文献报道70%～80%的HCC有N-ras高表达；肝癌细胞DNA中高表达的N-ras能使NIH/3T3细胞发生转化[6～8]，可见N-ras过量或异常表达的p21可能是肝癌形成的分子基础，阻断N-ras表达，可能抑制肝癌细胞增殖。N-ras启动子第二转录起始点下游含一个GGGGCGG盒的区域是N-ras启动子重要调控区，该区域又具有形成三螺旋结构特点[9，10]。因此，本文选择该区域及N-rasmRNA起始区为靶点进行TFO、ODNas抗肝癌细胞增殖的研究，尚未见类似的研究报道。
, 百拇医药
由于寡核苷酸在细胞内易被核酸酶降解、稳定性差，因此，本文合成了硫代修饰的硫代磷酸TFO、ODNas。实验表明TFO12、ODNas19能特异性抑制N-ras表达及Bel7402肝癌细胞增殖，其抑制与作用时间有关，并具有剂量依赖性。两者联合应用抑制作用增强，可能因联合应用时N-ras的表达在转录水平和翻译水平受到双重阻断。该结果说明不同功能区的三螺旋寡核苷酸或反义寡核苷酸联合应用可能提高对靶基因的抑制效果。
TFO12对p21合成、细胞增殖的抑制作用(88%、80.2%)强于ODNas19(77%、67.5%)，可能因TFO12作用于基因调控区及转录起始区，直接抑制转录之故。该结果提示基因调控区可能是基因阻断疗法的更佳靶位，值得进一步研究。
N-ras表达降低时，7402肝癌细胞生长受到抑制，而对N-ras表达无影响的无关序列硫代磷酸寡核苷酸对肝癌细胞生长也无作用，该结果进一步提示N-ras与肝细胞癌变有着内在的联系、激活的N-ras在肝癌发生以及维持其表型中起着重要作用。
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[参考文献]
1，Moffat AS. Triplex DNA finally Comes of age [J]. Science， 1991， 252： 1374.
2，Postel EH， Flint SJ， Kessler DJ， et al. Evidence that a triplex- forming oligodeoxyribonucleotide binds to the c- myc promoter in HeLa cells， thereby reducing c- myc [J]. Proc Natl Acad Sci USA 1991， 88： 8227.
3，Kim HG， Miller DM. A novel triplex- forming oligonucleotide targeted to human cyclin D1 (bcl- 1， proto- oncogene) promoter inhibits transcription in HeLa cells [J]. Biochemistry， 1998， 37(8)： 2666.
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4，Redner RR， Nienhuis AW. An oligomer complementary to c- myc mRNA inhibit proliferation of HL- 60 promyelocytic cells and induces differentiation [J]. Molecular and Cellular Biology， 1988， 8(2)： 963.
5，许毅，邓国仁，梁亚云，等.反义C-Ha-ras寡聚核苷酸对转化细胞的生长抑制及其p21蛋白合成的抑制[J].中国科学(B辑)，1990，1：64.
6，顾健人，田培坤，王翔，等.人原发性肝癌及7402细胞株和髓细胞白血病细胞株(K562)的癌基因(转化基因)的共同属性N-ras基因[J].中国科学(B辑)，1985，5：452.
7，顾健人.人原发性肝癌的癌基因和抗癌基因的研究进展[J].肝脏，1992，1(1)：109.
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8，顾健人，胡利富，万大方，等.人原发性肝癌转化基因N-ras的研究[J].肿瘤，1985，5(2)：5210.
9，Hall A， Brown R. Human N- ras： cDNA cloning and gene structure [J]. Nucleic Acids Research， 1985， 13(14)： 5255.
10Thorn JT， Todd AV， Warrilow D， et al. Characterization of the human N- ras promoter region [J]. Oncogene， 1991， 6： 1843.
收稿日期：1999-07-16;修回日期：1999-09-14, http://www.100md.com