骨肉瘤中Rb、p16、CDK4、cyclinD1蛋白的表达及其意义
作者：李扬 丘钜世 梁惠珍 曾瑜 罗灿峤 朱全胜
单位：曾瑜(中山医科大学第一附属医院儿科，广东广州510089)；李扬 丘钜世 梁惠珍 罗灿峤 朱全胜(中山医科大学病理教研室，广东广州510089)
关键词：骨肉瘤；免疫组织化学；Rb；p16；CDK4；cyclinD1
癌症000611
【摘要】目的：探讨骨肉瘤中Rb、p16、CDK4、cyclinD1的蛋白表达、相互关系及其意义。方法：应用免疫组化方法对40例骨肉瘤组织中Rb、p16、CDK4、cyclinD1的蛋白表达状况进行检测。结果：40例骨肉瘤Rb、p16蛋白表达缺失分别为72.5%(29/40)和22.5%(9/40);11例pRb阳性的骨肉瘤中8例p16阴性，29例pRb阴性的骨肉瘤中28例p16阳性；52.5%(21/40)的骨肉瘤中存在CDK4的过表达，11例pRb阳性的骨肉瘤8例CDK4蛋白呈过表达，3例弱阳性；3例pRb、p16均阳性的骨肉瘤CDK4呈过表达；骨肉瘤中pRb，p16，CDK4的总异常率达100%；40例骨肉瘤中未检出cyclinD1蛋白的过表达。结论：(1)Rb蛋白的缺失、CDK4蛋白的过表达是骨肉瘤中的常见事件；(2)骨肉瘤中p16与pRb的表达呈负相关；(3)Rb蛋白阳性的骨肉瘤，p16蛋白的缺失及/或CDK4蛋白的过表达，可能在pRb的过度磷酸化而失活以致骨肉瘤失控地增生中起着重要作用；(4)p16-CDK4-pRb通路的异常与骨肉瘤的发生密切相关。
, http://www.100md.com
中图分类号：R738.1 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)06-0544-04
Significance of Rb,p16,CDK4 and cyclinD1 expression in osteosarcomas
LI Yang, QIU Ju-shi, LIANG Hui-zhen, et al.
Department of Pathology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089,P.R.China
【 Abstract】 Objective： To evaluate the significance of Rb,p16,CDK4 and cyclinD1 protein expression in osteosarcomas and the relationship among these proteins. Methods: A total of 40 cases of osteosarcomas were examined for pRb,p16,CDK4 and cyclinD1 expression using immunohistochemistry. Results: There were 29(72.5% ) and 9(22.5% ) cases lack of pRb and p16 expression, respectively. In 11 pRb positive cases, 8 were negative for p16. In contrast, in 29 pRb negative samples,28 were positive for p16. CDK4 overexpression was observed in 52.5% (21/40) osteosarcoma specimens.Of the 11 pRb positive osteosarcomas,CDK4 overexpression was appeared in 8 cases although 3 cases were faintly positive.Overexpression of CDK4 was also observed in 3 cases of osteosarcomas which were both pRb and p16 positive.The percentage of total abnormality for pRb, p16 and CDK4 expression in our 40 osteosarcomas was 100% . Overexpression of cyclinD1 was not observed in these osteosarcomas. Conclusions: (1)Loss of pRb and overexpression of CDK4 are common molecular events in osteosarcoma. (2)There is a negative correlation between p16 and pRb protein expression in osteosarcoma. (3)In pRb positive osteosarcomas, loss of p16 and /or overexpression of CDK4 may play a critical role in the hyperphosphorylation of pRb resulting in uncontrolled cell proliferation. (4)The abnormality of p16- CDK4- pRb pathway is highly related to the pathogenesis of osteosarcoma.
, 百拇医药
Key words： Osteosarcoma; Immunohistochemistry; Rb; p16; CDK4; cyclinD1
失去控制地增生是肿瘤的显著特征。肿瘤细胞所获得的基因的损伤或基因表达的异常直接参与了细胞增殖周期的调节[1]。正常细胞进入细胞增殖周期必须经过G1→S检测点。现已知pRb是G1→S检测点的中心，野生型低磷酸化的pRb与转录因子E2F结合，抑制了E2F介导的S期相关基因的表达，从而阻止细胞通过G1→S关卡，抑制细胞的增殖；pRb的缺失或过度磷酸化可使pRb抗增生作用丧失。周期素D(cyclinD)与周期素依赖性激酶4(cyclin-dependent-kinase，CDK4)组成激酶复合物(cyclinD/CDK4)可使pRb磷酸化，而p16又可抑制cyclinD/CDK4的活性，p16-cyclinD/CDK4-Rb构成了细胞周期中G1→S检测点的“Rb通路”[1]。
, http://www.100md.com
骨肉瘤是青少年常见的恶性肿瘤，骨肉瘤中存在着较高频率的Rb基因的异常及Rb蛋白的缺失[2，3]；在Rb蛋白不缺失的骨肉瘤中是否存在着pRb磷酸化机制的异常，从而使pRb过度磷酸化而失活呢？我们应用免疫组化方法对骨肉瘤中Rb、p16、CDK4、cyclinD1蛋白的表达进行了检测，并对其相互关系及其意义进行了探讨。
1 材料和方法
1.1标本
本研究中采用的40例骨肉瘤标本，取自于中山医科大学病理教研室及中山医科大学肿瘤医院1994年～1999年的手术切除或穿刺活检的骨肉瘤标本，标本经10%中性福尔马林固定，14%硝酸溶液脱钙，常规石蜡包埋切片。
1.2 试剂
鼠抗人p16(ZJ11)、Rb(1F8)、CDK4(DCS-35)、cyclinD1(DCS-6)单克隆抗体及免疫组化VSAB试剂盒均购自美国Neomark公司。
, 百拇医药
1.3 方法
采用VSAB法，封闭前将切片放入0.01mol/L枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)中，微波修复(煮沸)10min，一抗p16(1∶100)、Rb(1∶200)、CDK4(1∶80)、cyclinD1(1∶200)均置4℃冰箱过夜，DAB显色，苏木素复染。用PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性片作阳性对照，此外，pRb还以瘤组织中正常间质细胞及血管内皮细胞作阳性内对照。
1.4 结果判定
pRb、CDK4、cyclinD1以细胞核出现棕黄色颗粒定为阳性，p16以细胞核和细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性。采用双盲法，随机计数10个高倍视野。按阳性细胞所占比例记录如下：无明显阳性细胞为阴性(-)；阳性细胞数<25%为(+)；阳性细胞数25%～50%为(++)；阳性细胞数>50%为(+++)。对于pRb和p16表达，阴性为异常；而对于CDK4，cyclinD1蛋白，过表达(++～+++)为异常。
, http://www.100md.com
1.5 统计学分析
采用χ2检验及确切概率分析。
2 结果
2.1 骨肉瘤中p16、Rb、CDK4和cyclinD1蛋白的表达
pRb、CDK4和cyclinD1的免疫反应产物位于细胞核内，p16位于细胞核和细胞浆内。瘤组织内的正常间质细胞和血管内皮细胞胞核可见pRb的阳性表达，正常间质细胞cyclinD1、CDK4蛋白的表达为阴性(-)或弱阳性(+)，p16在正常间质细胞内呈低表达。骨肉瘤组织中，29/40例(72.5%)pRb蛋白阴性，11/40例阳性(+～+++)；9/40例(22.5%)p16蛋白阴性，31/40例阳性(+～+++)；21/40例(52.5%)骨肉瘤中存在CDK4蛋白的过表达(++～+++)，19/40例CDK4蛋白呈低表达(-～+)；2/40例骨肉瘤cyclinD1蛋白弱阳性(+)，38/40例cyclinD1蛋白阴性，40例骨肉瘤组织中未检测到cyclinD1蛋白的过表达(图1～6)。
, http://www.100md.com
2.2 骨肉瘤中pRb、p16和CDK4蛋白表达的相关性
2.2.1骨肉瘤中pRb、p16表达的相关性：结果见表1，经统计学分析，pRb与p16的表达呈负相关(χ2=18.158,P<0.01)。
2.2.2 CDK4蛋白的过表达与pRb、p16表达的相关性：CDK4的表达与pRb、p16表达的相互关系见表2。经统计学分析，CDK4的过表达与pRb、p16的表达无相关性(P>0.05)，但11例pRb阳性的骨肉瘤8例CDK4蛋白呈过表达，3例弱阳性；3例pRb、p16均阳性的骨肉瘤CDK4蛋白呈过表达，40例骨肉瘤中pRb、p16、CDK4蛋白的总异常率达100%。
表1 骨肉瘤中pRb与p16蛋白表达的相互关系 pR16
, http://www.100md.com
n
p16
阳性(+～+++)
阴性(-)
阳性(+～+++)
11
3
8
阴性(-)
29
28
1
表2 骨肉瘤中CDK4蛋白的表达与pRb、p16表达的相互关系 CDK4
, http://www.100md.com
n
pRb
p16
(+～+++)
(-)
(+～+++)
(-)
过表达(++～+++)
21
8
13
16
5
, 百拇医药
低表达(-～+)
19
3
16
15
4
合计
40
11
29
3
9
χ2
, http://www.100md.com
1.496
0.029
P值
>0.05
>0.05
3 讨论
随着人们对细胞周期调控认识的不断深入，人们发现肿瘤实际上是一类细胞周期疾病，而瘤细胞实际上是一群细胞周期异常的细胞，尤其存在着细胞周期G1→S关卡的失控[4]。我们在骨肉瘤组织中检测了细胞周期G1→S相关蛋白pRb、p16、CDK4、cyclinD1的表达状态并探讨其相互关系。结果表明，骨肉瘤中pRb的缺失是一种常见的分子事件(72.5%)，这与国外Wadayama等[3]报道67%的骨肉瘤中存在Rb基因的突变或Rb基因的缺失相一致。本次实验所检测到pRb的缺失较我们以前检测到的高[2]，可能是两次使用不同的pRb抗体所致。该结果提示pRb的缺失在骨肉瘤的发生中起重要作用。29例pRb阴性的骨肉瘤中，28例p16阳性，而11例pRb阳性的骨肉瘤中，8例p16阴性，骨肉瘤中pRb与p16的表达呈明显的负相关，这与人们在肺癌、食管癌及胶质瘤中观察到的现象类似[5～7]；Yan等[8]学者提出pRb可抑制p16的mRNA的转录，我们在pRb阴性的骨肉瘤组织中，观察到p16的高表达，很可能是由于pRb的缺失，pRb对p16的转录抑制解除，从而导致p16表达升高所致。该结果也表明，骨肉瘤组织中也存在pRb对p16的负反馈调节关系。由于p16可抑制cyclinD1/CDK4激酶的活性，抑制pRb的磷酸化，在pRb阳性的骨肉瘤中p16阴性，提示在这部分骨肉瘤中很可能由于p16蛋白缺失，未能抑制cyclinD/CDK4，后者活性升高使pRb磷酸化而失活。
, http://www.100md.com
图1骨肉瘤细胞pRb阴性，瘤细胞阴性，内对照(血管内皮细胞及正常间质细胞)阳性VSAB×400
图2骨肉瘤细胞pRb阳性，阳性信号位于细胞核内VSAB×400
图3骨肉瘤细胞p16阳性(+++)，阳性信号位于细胞核和细胞浆内VSAB×400(图3与图1为同一病例)
图4骨肉瘤细胞p16阴性VSAB×400(图4与图2为同一病例)
图5骨肉瘤细胞CDK4蛋白过表达(+++)，阳性信号位于细胞核内VSAB×400
, 百拇医药
图6少数骨肉瘤细胞cyclinD1蛋白阳性，阳性信号位于细胞核内VSAB×200
本实验显示52.5%的骨肉瘤存在着CDK4蛋白的过表达，提示CDK4蛋白的过表达在骨肉瘤的发生中起重要作用。进一步分析CDK4蛋白的表达与pRb的关系，我们发现，尽管CDK4蛋白的过表达与pRb、p16的表达无相关性，但11例pRb阳性的骨肉瘤均存在着CDK4蛋白的表达，其中8例为过表达，3例弱阳性，而11例中又有8例p16阴性，这一结果提示，在pRb阳性的骨肉瘤中可能由于CDK4蛋白的过表达，而p16蛋白缺失，未能抑制CDK4，过表达的CDK4使pRb磷酸化而失活，从而导致骨肉瘤细胞自动通过细胞周期G1→S关卡，呈现失控的增生。3例pRb、p16均阳性的骨肉瘤CDK4蛋白呈过表达，可能意味着CDK4蛋白过表达的生物学效应超过了pRb、p16对细胞周期的抑制作用。21例CDK4蛋白过表达的骨肉瘤中，除了8例pRb阳性外，13例pRb阴性，提示骨肉瘤中CDK4的过表达，除了使pRb过度磷酸化外，可能尚具有其它的功能[9]。骨肉瘤中pRb，p16，CDK4蛋白的总异常率达100%，表明p16-CDK4-pRb通路的异常与骨肉瘤的发生密切相关。骨肉瘤中未能检测到cyclinD1蛋白的过表达，而同一批实验中的食管癌组织中却检测到cyclinD1蛋白的过表达，提示在骨肉瘤失控的增生中，可能cyclinD1过表达不起主要作用。Ewen等报道将野生型Rb与cyclinD1共同导入Rb缺失的骨肉瘤细胞株SAOS-2中，未能发现pRb的过度磷酸化，而将Rb与cyclinD2导入SAOS-2中，则可检测到pRb的过度磷酸化，提示骨肉瘤细胞中，cyclinD1与cyclinD2的作用不一样[10]，cyclinD2可能在pRb的过磷酸化中起主要作用；Benassi等也报道骨肉瘤组织中只检测到低水平的cyclinD1/CDK4复合物的存在[11]。在骨肉瘤组织中是否存在cyclinD2蛋白的过表达，有待于进一步的研究。
, 百拇医药
基金项目：本课题受中山医科大学“211工程”重点学科建设经费(No：98028)资助
[参考文献]
1，Sherr CJ. Cancer cell cycles[J]. Science, 1996,274:1672～ 1677.
2，李扬,丘钜世.侵袭性骨肿瘤中Rb基因及其蛋白产物表达的研究[J].中华病理学杂志,1997,26:262～265.
3，Wadayama B, Toguchida J, Shimizu T, et al. Mutation spectrum of the retinoblastoma gene in osteosarcomas[J]. Cancer Res, 1994,54:3024～ 3048.
4，Clurman BE, Roberts JM. Cell cycle and cancer[J]. J Nat Cancer Inst [J]. 1995,87:1499～ 1501.
, 百拇医药
5，Sakaguchi M, Fujii Y, Hirabayashi H, et al. Inversely correlated expression of p16 and Rb protein in non small cell lung cancers: an immunohistochemical study [J]. Int J Cancer,1996,65:442～ 445.
6，郑杰,周传农,萧枫,等.Rb、p16细胞周期素D1蛋白在食管癌中的表达及其意义[J].中华病理学杂志,1996,25:336～339.
7，Ueki K, Ono Y, Henson JW, et al. CDKN2/p16 or RB alteration occur in the majority of glioblastomas and are inversely correlated[J]. Cancer Res, 1996,56:150～ 153.
, 百拇医药
8，Li Y, Nichols MA, Shay JW, et al. Transcriptional repression of the D- type cyclin- dependent kinase inhibitor p16 by the retinoblastoma susceptibility gene product pRb[J]. Cancer Res,1994,54:6078～ 6082.
9，Kanoe H, Nakayama T, Murakami H, et al. Amplification of the CDK4 gene in sarcomas: tumor specificity and relationship with the Rb gene mutation[J]. Anticancer Res, 1998,18:2317～ 2321.
10，Ewen ME, Shuss HE, Sherr CJ, et al. Functional interactions of the retinoblastoma protein with mammalian D type cyclins[J]. Cell,1993,73:487～ 497.
11，Benassi MS, Molendini L, Gamberi G, et al. Altered G1 phase regulation in osteosarcoma [J]. Int J Cancer, 1997, 74:518～ 522.
收稿日期：1999-10-08；修回日期：1999-10-25, 百拇医药
单位：曾瑜(中山医科大学第一附属医院儿科，广东广州510089)；李扬 丘钜世 梁惠珍 罗灿峤 朱全胜(中山医科大学病理教研室，广东广州510089)
关键词：骨肉瘤；免疫组织化学；Rb；p16；CDK4；cyclinD1
癌症000611
【摘要】目的：探讨骨肉瘤中Rb、p16、CDK4、cyclinD1的蛋白表达、相互关系及其意义。方法：应用免疫组化方法对40例骨肉瘤组织中Rb、p16、CDK4、cyclinD1的蛋白表达状况进行检测。结果：40例骨肉瘤Rb、p16蛋白表达缺失分别为72.5%(29/40)和22.5%(9/40);11例pRb阳性的骨肉瘤中8例p16阴性，29例pRb阴性的骨肉瘤中28例p16阳性；52.5%(21/40)的骨肉瘤中存在CDK4的过表达，11例pRb阳性的骨肉瘤8例CDK4蛋白呈过表达，3例弱阳性；3例pRb、p16均阳性的骨肉瘤CDK4呈过表达；骨肉瘤中pRb，p16，CDK4的总异常率达100%；40例骨肉瘤中未检出cyclinD1蛋白的过表达。结论：(1)Rb蛋白的缺失、CDK4蛋白的过表达是骨肉瘤中的常见事件；(2)骨肉瘤中p16与pRb的表达呈负相关；(3)Rb蛋白阳性的骨肉瘤，p16蛋白的缺失及/或CDK4蛋白的过表达，可能在pRb的过度磷酸化而失活以致骨肉瘤失控地增生中起着重要作用；(4)p16-CDK4-pRb通路的异常与骨肉瘤的发生密切相关。
, http://www.100md.com
中图分类号：R738.1 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)06-0544-04
Significance of Rb,p16,CDK4 and cyclinD1 expression in osteosarcomas
LI Yang, QIU Ju-shi, LIANG Hui-zhen, et al.
Department of Pathology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089,P.R.China
【 Abstract】 Objective： To evaluate the significance of Rb,p16,CDK4 and cyclinD1 protein expression in osteosarcomas and the relationship among these proteins. Methods: A total of 40 cases of osteosarcomas were examined for pRb,p16,CDK4 and cyclinD1 expression using immunohistochemistry. Results: There were 29(72.5% ) and 9(22.5% ) cases lack of pRb and p16 expression, respectively. In 11 pRb positive cases, 8 were negative for p16. In contrast, in 29 pRb negative samples,28 were positive for p16. CDK4 overexpression was observed in 52.5% (21/40) osteosarcoma specimens.Of the 11 pRb positive osteosarcomas,CDK4 overexpression was appeared in 8 cases although 3 cases were faintly positive.Overexpression of CDK4 was also observed in 3 cases of osteosarcomas which were both pRb and p16 positive.The percentage of total abnormality for pRb, p16 and CDK4 expression in our 40 osteosarcomas was 100% . Overexpression of cyclinD1 was not observed in these osteosarcomas. Conclusions: (1)Loss of pRb and overexpression of CDK4 are common molecular events in osteosarcoma. (2)There is a negative correlation between p16 and pRb protein expression in osteosarcoma. (3)In pRb positive osteosarcomas, loss of p16 and /or overexpression of CDK4 may play a critical role in the hyperphosphorylation of pRb resulting in uncontrolled cell proliferation. (4)The abnormality of p16- CDK4- pRb pathway is highly related to the pathogenesis of osteosarcoma.
, 百拇医药
Key words： Osteosarcoma; Immunohistochemistry; Rb; p16; CDK4; cyclinD1
失去控制地增生是肿瘤的显著特征。肿瘤细胞所获得的基因的损伤或基因表达的异常直接参与了细胞增殖周期的调节[1]。正常细胞进入细胞增殖周期必须经过G1→S检测点。现已知pRb是G1→S检测点的中心，野生型低磷酸化的pRb与转录因子E2F结合，抑制了E2F介导的S期相关基因的表达，从而阻止细胞通过G1→S关卡，抑制细胞的增殖；pRb的缺失或过度磷酸化可使pRb抗增生作用丧失。周期素D(cyclinD)与周期素依赖性激酶4(cyclin-dependent-kinase，CDK4)组成激酶复合物(cyclinD/CDK4)可使pRb磷酸化，而p16又可抑制cyclinD/CDK4的活性，p16-cyclinD/CDK4-Rb构成了细胞周期中G1→S检测点的“Rb通路”[1]。
, http://www.100md.com
骨肉瘤是青少年常见的恶性肿瘤，骨肉瘤中存在着较高频率的Rb基因的异常及Rb蛋白的缺失[2，3]；在Rb蛋白不缺失的骨肉瘤中是否存在着pRb磷酸化机制的异常，从而使pRb过度磷酸化而失活呢？我们应用免疫组化方法对骨肉瘤中Rb、p16、CDK4、cyclinD1蛋白的表达进行了检测，并对其相互关系及其意义进行了探讨。
1 材料和方法
1.1标本
本研究中采用的40例骨肉瘤标本，取自于中山医科大学病理教研室及中山医科大学肿瘤医院1994年～1999年的手术切除或穿刺活检的骨肉瘤标本，标本经10%中性福尔马林固定，14%硝酸溶液脱钙，常规石蜡包埋切片。
1.2 试剂
鼠抗人p16(ZJ11)、Rb(1F8)、CDK4(DCS-35)、cyclinD1(DCS-6)单克隆抗体及免疫组化VSAB试剂盒均购自美国Neomark公司。
, 百拇医药
1.3 方法
采用VSAB法，封闭前将切片放入0.01mol/L枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)中，微波修复(煮沸)10min，一抗p16(1∶100)、Rb(1∶200)、CDK4(1∶80)、cyclinD1(1∶200)均置4℃冰箱过夜，DAB显色，苏木素复染。用PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性片作阳性对照，此外，pRb还以瘤组织中正常间质细胞及血管内皮细胞作阳性内对照。
1.4 结果判定
pRb、CDK4、cyclinD1以细胞核出现棕黄色颗粒定为阳性，p16以细胞核和细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性。采用双盲法，随机计数10个高倍视野。按阳性细胞所占比例记录如下：无明显阳性细胞为阴性(-)；阳性细胞数<25%为(+)；阳性细胞数25%～50%为(++)；阳性细胞数>50%为(+++)。对于pRb和p16表达，阴性为异常；而对于CDK4，cyclinD1蛋白，过表达(++～+++)为异常。
, http://www.100md.com
1.5 统计学分析
采用χ2检验及确切概率分析。
2 结果
2.1 骨肉瘤中p16、Rb、CDK4和cyclinD1蛋白的表达
pRb、CDK4和cyclinD1的免疫反应产物位于细胞核内，p16位于细胞核和细胞浆内。瘤组织内的正常间质细胞和血管内皮细胞胞核可见pRb的阳性表达，正常间质细胞cyclinD1、CDK4蛋白的表达为阴性(-)或弱阳性(+)，p16在正常间质细胞内呈低表达。骨肉瘤组织中，29/40例(72.5%)pRb蛋白阴性，11/40例阳性(+～+++)；9/40例(22.5%)p16蛋白阴性，31/40例阳性(+～+++)；21/40例(52.5%)骨肉瘤中存在CDK4蛋白的过表达(++～+++)，19/40例CDK4蛋白呈低表达(-～+)；2/40例骨肉瘤cyclinD1蛋白弱阳性(+)，38/40例cyclinD1蛋白阴性，40例骨肉瘤组织中未检测到cyclinD1蛋白的过表达(图1～6)。
, http://www.100md.com
2.2 骨肉瘤中pRb、p16和CDK4蛋白表达的相关性
2.2.1骨肉瘤中pRb、p16表达的相关性：结果见表1，经统计学分析，pRb与p16的表达呈负相关(χ2=18.158,P<0.01)。
2.2.2 CDK4蛋白的过表达与pRb、p16表达的相关性：CDK4的表达与pRb、p16表达的相互关系见表2。经统计学分析，CDK4的过表达与pRb、p16的表达无相关性(P>0.05)，但11例pRb阳性的骨肉瘤8例CDK4蛋白呈过表达，3例弱阳性；3例pRb、p16均阳性的骨肉瘤CDK4蛋白呈过表达，40例骨肉瘤中pRb、p16、CDK4蛋白的总异常率达100%。
表1 骨肉瘤中pRb与p16蛋白表达的相互关系 pR16
, http://www.100md.com
n
p16
阳性(+～+++)
阴性(-)
阳性(+～+++)
11
3
8
阴性(-)
29
28
1
表2 骨肉瘤中CDK4蛋白的表达与pRb、p16表达的相互关系 CDK4
, http://www.100md.com
n
pRb
p16
(+～+++)
(-)
(+～+++)
(-)
过表达(++～+++)
21
8
13
16
5
, 百拇医药
低表达(-～+)
19
3
16
15
4
合计
40
11
29
3
9
χ2
, http://www.100md.com
1.496
0.029
P值
>0.05
>0.05
3 讨论
随着人们对细胞周期调控认识的不断深入，人们发现肿瘤实际上是一类细胞周期疾病，而瘤细胞实际上是一群细胞周期异常的细胞，尤其存在着细胞周期G1→S关卡的失控[4]。我们在骨肉瘤组织中检测了细胞周期G1→S相关蛋白pRb、p16、CDK4、cyclinD1的表达状态并探讨其相互关系。结果表明，骨肉瘤中pRb的缺失是一种常见的分子事件(72.5%)，这与国外Wadayama等[3]报道67%的骨肉瘤中存在Rb基因的突变或Rb基因的缺失相一致。本次实验所检测到pRb的缺失较我们以前检测到的高[2]，可能是两次使用不同的pRb抗体所致。该结果提示pRb的缺失在骨肉瘤的发生中起重要作用。29例pRb阴性的骨肉瘤中，28例p16阳性，而11例pRb阳性的骨肉瘤中，8例p16阴性，骨肉瘤中pRb与p16的表达呈明显的负相关，这与人们在肺癌、食管癌及胶质瘤中观察到的现象类似[5～7]；Yan等[8]学者提出pRb可抑制p16的mRNA的转录，我们在pRb阴性的骨肉瘤组织中，观察到p16的高表达，很可能是由于pRb的缺失，pRb对p16的转录抑制解除，从而导致p16表达升高所致。该结果也表明，骨肉瘤组织中也存在pRb对p16的负反馈调节关系。由于p16可抑制cyclinD1/CDK4激酶的活性，抑制pRb的磷酸化，在pRb阳性的骨肉瘤中p16阴性，提示在这部分骨肉瘤中很可能由于p16蛋白缺失，未能抑制cyclinD/CDK4，后者活性升高使pRb磷酸化而失活。
, http://www.100md.com
图1骨肉瘤细胞pRb阴性，瘤细胞阴性，内对照(血管内皮细胞及正常间质细胞)阳性VSAB×400
图2骨肉瘤细胞pRb阳性，阳性信号位于细胞核内VSAB×400
图3骨肉瘤细胞p16阳性(+++)，阳性信号位于细胞核和细胞浆内VSAB×400(图3与图1为同一病例)
图4骨肉瘤细胞p16阴性VSAB×400(图4与图2为同一病例)
图5骨肉瘤细胞CDK4蛋白过表达(+++)，阳性信号位于细胞核内VSAB×400
, 百拇医药
图6少数骨肉瘤细胞cyclinD1蛋白阳性，阳性信号位于细胞核内VSAB×200
本实验显示52.5%的骨肉瘤存在着CDK4蛋白的过表达，提示CDK4蛋白的过表达在骨肉瘤的发生中起重要作用。进一步分析CDK4蛋白的表达与pRb的关系，我们发现，尽管CDK4蛋白的过表达与pRb、p16的表达无相关性，但11例pRb阳性的骨肉瘤均存在着CDK4蛋白的表达，其中8例为过表达，3例弱阳性，而11例中又有8例p16阴性，这一结果提示，在pRb阳性的骨肉瘤中可能由于CDK4蛋白的过表达，而p16蛋白缺失，未能抑制CDK4，过表达的CDK4使pRb磷酸化而失活，从而导致骨肉瘤细胞自动通过细胞周期G1→S关卡，呈现失控的增生。3例pRb、p16均阳性的骨肉瘤CDK4蛋白呈过表达，可能意味着CDK4蛋白过表达的生物学效应超过了pRb、p16对细胞周期的抑制作用。21例CDK4蛋白过表达的骨肉瘤中，除了8例pRb阳性外，13例pRb阴性，提示骨肉瘤中CDK4的过表达，除了使pRb过度磷酸化外，可能尚具有其它的功能[9]。骨肉瘤中pRb，p16，CDK4蛋白的总异常率达100%，表明p16-CDK4-pRb通路的异常与骨肉瘤的发生密切相关。骨肉瘤中未能检测到cyclinD1蛋白的过表达，而同一批实验中的食管癌组织中却检测到cyclinD1蛋白的过表达，提示在骨肉瘤失控的增生中，可能cyclinD1过表达不起主要作用。Ewen等报道将野生型Rb与cyclinD1共同导入Rb缺失的骨肉瘤细胞株SAOS-2中，未能发现pRb的过度磷酸化，而将Rb与cyclinD2导入SAOS-2中，则可检测到pRb的过度磷酸化，提示骨肉瘤细胞中，cyclinD1与cyclinD2的作用不一样[10]，cyclinD2可能在pRb的过磷酸化中起主要作用；Benassi等也报道骨肉瘤组织中只检测到低水平的cyclinD1/CDK4复合物的存在[11]。在骨肉瘤组织中是否存在cyclinD2蛋白的过表达，有待于进一步的研究。
, 百拇医药
基金项目：本课题受中山医科大学“211工程”重点学科建设经费(No：98028)资助
[参考文献]
1，Sherr CJ. Cancer cell cycles[J]. Science, 1996,274:1672～ 1677.
2，李扬,丘钜世.侵袭性骨肿瘤中Rb基因及其蛋白产物表达的研究[J].中华病理学杂志,1997,26:262～265.
3，Wadayama B, Toguchida J, Shimizu T, et al. Mutation spectrum of the retinoblastoma gene in osteosarcomas[J]. Cancer Res, 1994,54:3024～ 3048.
4，Clurman BE, Roberts JM. Cell cycle and cancer[J]. J Nat Cancer Inst [J]. 1995,87:1499～ 1501.
, 百拇医药
5，Sakaguchi M, Fujii Y, Hirabayashi H, et al. Inversely correlated expression of p16 and Rb protein in non small cell lung cancers: an immunohistochemical study [J]. Int J Cancer,1996,65:442～ 445.
6，郑杰,周传农,萧枫,等.Rb、p16细胞周期素D1蛋白在食管癌中的表达及其意义[J].中华病理学杂志,1996,25:336～339.
7，Ueki K, Ono Y, Henson JW, et al. CDKN2/p16 or RB alteration occur in the majority of glioblastomas and are inversely correlated[J]. Cancer Res, 1996,56:150～ 153.
, 百拇医药
8，Li Y, Nichols MA, Shay JW, et al. Transcriptional repression of the D- type cyclin- dependent kinase inhibitor p16 by the retinoblastoma susceptibility gene product pRb[J]. Cancer Res,1994,54:6078～ 6082.
9，Kanoe H, Nakayama T, Murakami H, et al. Amplification of the CDK4 gene in sarcomas: tumor specificity and relationship with the Rb gene mutation[J]. Anticancer Res, 1998,18:2317～ 2321.
10，Ewen ME, Shuss HE, Sherr CJ, et al. Functional interactions of the retinoblastoma protein with mammalian D type cyclins[J]. Cell,1993,73:487～ 497.
11，Benassi MS, Molendini L, Gamberi G, et al. Altered G1 phase regulation in osteosarcoma [J]. Int J Cancer, 1997, 74:518～ 522.
收稿日期：1999-10-08；修回日期：1999-10-25, 百拇医药