肺癌组织中端粒酶活性的研究
作者：杨炯 李欣 李清泉
单位：杨炯 李欣 李清泉(430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院呼吸内科)
关键词：肺肿瘤；端粒酶；聚合酶链反应；病理类型
中国肺癌杂志000206 【摘要】 目的 探讨端粒酶的表达与原发性肺癌的病理类型、病理分期及淋巴结转移之间的关系。方法 采用端粒重复扩增技术(TRAP)-PCR-ELISA定量分析及TRAP-PCR银染定性分析分法，对24例肺癌新鲜手术标本及6例肺良性肿瘤手术标本进行端粒酶活性的分析。结果 肺癌组织端粒酶水平明显高于良性肿瘤组织。端粒酶在肺癌组织中的阳性检出率为75%；肺鳞癌端粒酶活性水平高于腺癌，两者差异有显著性(t＝2.235，P<0.05)；随肿瘤范围的扩大以及病理分期的增高，患者的端粒酶阳性率有相对增加的趋势。结论 端粒酶激活与肺癌的发生发展有密切关系，并有可能成为肺癌的诊断、治疗和预后的有用手段之一。
, 百拇医药
Telomerase activity in human primary lung caner
YANG Jiong, LI Xin, LI Qingquan. Respiratory Department, First Affliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan, Hubei 430060, P.R.China
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between telomarase activity and primary lung cancer.Methods Telomerase activity was detected in 24 primary lung cancer tissues and 6 benign neoplasms of the lungs by telomeric repeat amplification protocol (TRAP)-PCR-ELISA and TRAP-silver staining.Results The levels of telomerase activity in primary lung cancer tissues were significantly higher than those in benign neoplasms. Positive rate of telomerase activity in lung cancer tissues was 75%. The level of telomerase activity in squmaous cell carcinomas was significantly higher than that in adenocarcinomas (t＝2.235, P<0.05). The positive rate of telomerase was 50% in stage Ⅱ lung cancer and 92.3% in stage Ⅲ disease. Conclusion Telomerase expression might be involved in the oncogenesis and progression of lung cancer and could be used as a tumor marker in the diagnosis of lung cancer.
, 百拇医药
【Key words】 Lung neoplasms Telomerase Polymerase chain reaction Hostologic type
端粒对维持染色体的稳定性、一致性及染色体功能等具有重要作用。端粒酶是一种特殊的逆转录酶，它以自身的RNA为模板，合成端粒DNA而维持端粒的长度并使体细胞得以无限制地分裂[1，2]。端粒酶可使体细胞得以无限制生长的特性，使其在肿瘤研究中日益受到重视。本研究旨在探讨端粒酶在不同组织学类型肺癌中的表达差异及在临床分期中的意义。
1 材料与方法
1.1 标本来源 30例标本取自本院1997年7月至1998年12月间肺部肿瘤手术患者，所有患者均经病理证实且在术前未进行过化疗或放疗。患者年龄34～68岁，男性24例，女性6例。其中腺癌11例，鳞癌10例，其他类型肺癌3例(大细胞癌2例，小细胞癌1例)，临床分期包括Ⅰ期1例，Ⅱ期10例，Ⅲ期13例。另有良性肿瘤6例，包括肺结核瘤3例，海绵状血管瘤及肺炎性假瘤各1例。采取到组织后，立即放入经处理的试管内，经液氮冻凝后，-80℃储存备用。
, http://www.100md.com
1.2 试剂 端粒酶PCR-ELISA检测试剂盒由德国宝灵曼公司提供。
1.3 端粒重复扩增技术(TRAP)-PCR-ELISA 取细胞提取液1～5 μl(蛋白含量50 μg)加入25 μl TRAP PCR扩增液，用无菌DEPC水补足至体积50 μl混匀，覆盖石蜡油，在PCR扩增仪(Hema48型)上按以下步骤进行引物的延伸及扩增反应：引物延伸，时间30 min，温度25℃。端粒酶灭活，时间5 min，温度94℃。扩增：变性30 s 94℃，退火30 s 50℃，聚合90 s 72℃，30个循环后，72℃ 10 min。
取上述PCR产物5 μl加变性液20 μl混匀，放置室温15～20 min，加入杂交液225 μl混匀后取出100 μl包被于抗地高辛的酶标板中室温作用3 h，加入过氧化物酶并与TMB底物显色作用30 min后终止反应，用酶标检测(BIO-Rad Model 550型)测其在波长450 nm的吸光度(A)。
, 百拇医药
1.4 PCR产物检测 将PCR产物行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和硝酸银染色[3]。凝胶用10%乙醇固定5 min，水洗2次；然后在1%硝酸浸胶5 min，水洗2次；染色液浸胶10 min，水洗3次；加入少许显色液洗胶2次，再加入剩余显色液轻摇直至条带出现，水洗3次；10%乙酸浸胶5～10 min，水洗3次，观察结果；制膜干燥保存。
1.5 结果判断 端粒酶活性阳性标本经PCR扩增形成6核苷酸(5′-TTAGGG-3′)重复片段，在银染的SDS-PAGE凝胶上形成等距离梯形条带图谱。
1.6 数据处理 数据以均数和率表示，采用t检验、秩和检验、四格表确切概率法。
2 结果
2.1 肺组织标本端粒酶活性水平定量分析 30例肺组织标本中，肺癌标本中的端粒酶活性水平明显高于肺良性肿瘤(秩和检验：u＝2.955，0.05
表1 不同肺组织标本的端粒酶活性水平比较
Tab 1 Comparison of telomerase activities of different pulmonary tissues Pulmonary tissues
No. of cases
Range of
A value
Average
A value
Lung cancer
24
1.045-1.153
, http://www.100md.com
0.195
Squamous cell carcinoma
10
0.064-0.456
0.201
Adenocarcinoma
11
0.045-0.227
0.112
Large cell carcinoma
2
0.140-0.146
, 百拇医药
0.143
Small cell carcinoma
1
1.153
Benign neoplasms
6
0.035-0.085
0.058
2.2 肺组织标本端粒酶活性的定性分析 肺癌手术标本的端粒酶阳性检出率为75%(18/24)，其中腺癌的阳性率为54.5%(6/11)，鳞癌的阳性率为90%(9/10)；肺良性肿瘤的端粒酶检出率为0。肺癌TNM分期(依据1987年UICC肺癌的国际分期标准确定)与端粒酶的关系见表2，由于病例数少，未进行统计学处理。但可以看出，原发肿瘤越大、病期越晚，端粒酶阳性率有相对增加的趋势。表2 肺癌病理生理特征与端粒酶的关系
, 百拇医药
Tab 2 Relation between telomerase and pathophysiological
characteristics of lung cancer Characteristics
No. of cases
No. of positive cases
Positive rate
Tumor size
T1
2
1
50%
, http://www.100md.com
T2
11
7
63.6%
T3
11
10
90.9%
Lymph node metastasis
N0
5
4
80%
, 百拇医药
N1
12
8
66.7%
N2
3
2
66.7%
N3
4
4
100%
Stage
, http://www.100md.com Ⅰ
1
1
100%
Ⅱ
10
5
50%
Ⅲ
13
12
92.3%
3 讨论
端粒酶存在于大部分肿瘤细胞中，正常体细胞检测不到端粒酶活性。端粒酶活化是细胞永生性的必须途径，而获得永生是肿瘤恶变的重要一步。因此有学者提出了恶性肿瘤发生的端粒酶理论，认为端粒酶的激活是恶性肿瘤发生学上的一个共同途径，而端粒酶则是各种肿瘤细胞的一个共同的标志物[1，2]。
, 百拇医药
肺癌是一种很普遍的致命的恶性肿瘤，其发病率在20世纪以来已大为提高。Hiyama等人在研究肺癌与端粒酶的关系时发现80.1%的肺癌显示端粒酶激活，其中小细胞肺癌为100%，非小细胞肺癌为72.9%～81.8%[4]。本研究主要检测非小细胞肺癌端粒酶活性。23例患者中17例为端粒酶阳性，占73.9%，与报道相符，而6例肺良性肿瘤中均未检测到端粒酶活性。
Yashima等的研究发现，在肺鳞状细胞癌的发病机理中，很早即可发生支气管上皮出现端粒酶不规则表达；而在腺癌中，端粒酶活化是一个晚期或偶发事件[5]。在我们的实验中腺癌的端粒酶阳性率为54.5%(6/11)，鳞癌的阳性率为90%(9/10)，两者之间差别没有显著性。这可能与本组样本量较小，病例数较少有关。但是腺癌端粒酶活性水平(0.112)显著低于鳞癌(0.201)，差别有显著性(P<0.05)。
另有研究表明，手术分期较晚患者的端粒酶阳性率有相对增加的趋势。原发性非小细胞肺癌中，高水平端粒酶激活常见于具有高细胞增殖率的标本，且端粒酶激活在晚期疾病中的表达水平较早期要高得多[6]。本组病例数小，不能肯定端粒酶的表达与患者肿瘤大小和淋巴结移情况有关，但随着肿瘤进展，其端粒酶阳性率有相对增加的趋势。端粒酶活性在晚期癌变中的表达高于早期癌变，提示端粒酶表达水平的高低可能与肿瘤细胞侵袭，肿瘤进展和转移潜能相关。临床有高效端粒酶激活的非小细胞肺癌患者比端粒酶阴性患者的预后更差。因而端粒酶活性的检测有可能成为判断预后的指标。
, http://www.100md.com
综上，本研究结果初步显示端粒酶活性检测可能是预测肺癌的发生、发展及预后的有效方法，临床上由此可能会派生出以端粒酶为靶点的治疗肺癌的药物或肺癌的基因治疗方法。
本研究受湖北省自然科学基金(SJ96J070)资助
参 考 文 献
1，Seachrist L. Telomeres draw a crawd at Toronto cancer meeting. Science,1995,268(1)∶29-30.
2，Greider CW, Blackburn EH. Telomeres, telomerase and cancer. Scientific Am,1996,274(1)∶92-97.
3，张行，杨骅，程浩，等.端粒酶活性检测的临床应用.中国实验诊断学，1997，1(3)∶26-28.
, 百拇医药
4，Hiyama K, Hiyama E, Ishioka S, et al. Telomerase activity in small cell and non-small cell lung cancers. J Natl Cancer Inst,1995,87(6)∶895-902.
5，Yashima K, Litzky LA, Kaisar L, et al. Telomerase expression in respiratory epithelium during the multistage pathogenesis of lung carcinomas. Cancer Res,1997,57(12)∶2373-2377.
6，Shay JW, Gazdar AF. Telomerase in the early detection of cancer. J Clin Pathol,1997,50(1)∶106-109.
(收稿：2000-01-25 修回：2000-04-10), http://www.100md.com
单位：杨炯 李欣 李清泉(430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院呼吸内科)
关键词：肺肿瘤；端粒酶；聚合酶链反应；病理类型
中国肺癌杂志000206 【摘要】 目的 探讨端粒酶的表达与原发性肺癌的病理类型、病理分期及淋巴结转移之间的关系。方法 采用端粒重复扩增技术(TRAP)-PCR-ELISA定量分析及TRAP-PCR银染定性分析分法，对24例肺癌新鲜手术标本及6例肺良性肿瘤手术标本进行端粒酶活性的分析。结果 肺癌组织端粒酶水平明显高于良性肿瘤组织。端粒酶在肺癌组织中的阳性检出率为75%；肺鳞癌端粒酶活性水平高于腺癌，两者差异有显著性(t＝2.235，P<0.05)；随肿瘤范围的扩大以及病理分期的增高，患者的端粒酶阳性率有相对增加的趋势。结论 端粒酶激活与肺癌的发生发展有密切关系，并有可能成为肺癌的诊断、治疗和预后的有用手段之一。
, 百拇医药
Telomerase activity in human primary lung caner
YANG Jiong, LI Xin, LI Qingquan. Respiratory Department, First Affliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan, Hubei 430060, P.R.China
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between telomarase activity and primary lung cancer.Methods Telomerase activity was detected in 24 primary lung cancer tissues and 6 benign neoplasms of the lungs by telomeric repeat amplification protocol (TRAP)-PCR-ELISA and TRAP-silver staining.Results The levels of telomerase activity in primary lung cancer tissues were significantly higher than those in benign neoplasms. Positive rate of telomerase activity in lung cancer tissues was 75%. The level of telomerase activity in squmaous cell carcinomas was significantly higher than that in adenocarcinomas (t＝2.235, P<0.05). The positive rate of telomerase was 50% in stage Ⅱ lung cancer and 92.3% in stage Ⅲ disease. Conclusion Telomerase expression might be involved in the oncogenesis and progression of lung cancer and could be used as a tumor marker in the diagnosis of lung cancer.
, 百拇医药
【Key words】 Lung neoplasms Telomerase Polymerase chain reaction Hostologic type
端粒对维持染色体的稳定性、一致性及染色体功能等具有重要作用。端粒酶是一种特殊的逆转录酶，它以自身的RNA为模板，合成端粒DNA而维持端粒的长度并使体细胞得以无限制地分裂[1，2]。端粒酶可使体细胞得以无限制生长的特性，使其在肿瘤研究中日益受到重视。本研究旨在探讨端粒酶在不同组织学类型肺癌中的表达差异及在临床分期中的意义。
1 材料与方法
1.1 标本来源 30例标本取自本院1997年7月至1998年12月间肺部肿瘤手术患者，所有患者均经病理证实且在术前未进行过化疗或放疗。患者年龄34～68岁，男性24例，女性6例。其中腺癌11例，鳞癌10例，其他类型肺癌3例(大细胞癌2例，小细胞癌1例)，临床分期包括Ⅰ期1例，Ⅱ期10例，Ⅲ期13例。另有良性肿瘤6例，包括肺结核瘤3例，海绵状血管瘤及肺炎性假瘤各1例。采取到组织后，立即放入经处理的试管内，经液氮冻凝后，-80℃储存备用。
, http://www.100md.com
1.2 试剂 端粒酶PCR-ELISA检测试剂盒由德国宝灵曼公司提供。
1.3 端粒重复扩增技术(TRAP)-PCR-ELISA 取细胞提取液1～5 μl(蛋白含量50 μg)加入25 μl TRAP PCR扩增液，用无菌DEPC水补足至体积50 μl混匀，覆盖石蜡油，在PCR扩增仪(Hema48型)上按以下步骤进行引物的延伸及扩增反应：引物延伸，时间30 min，温度25℃。端粒酶灭活，时间5 min，温度94℃。扩增：变性30 s 94℃，退火30 s 50℃，聚合90 s 72℃，30个循环后，72℃ 10 min。
取上述PCR产物5 μl加变性液20 μl混匀，放置室温15～20 min，加入杂交液225 μl混匀后取出100 μl包被于抗地高辛的酶标板中室温作用3 h，加入过氧化物酶并与TMB底物显色作用30 min后终止反应，用酶标检测(BIO-Rad Model 550型)测其在波长450 nm的吸光度(A)。
, 百拇医药
1.4 PCR产物检测 将PCR产物行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和硝酸银染色[3]。凝胶用10%乙醇固定5 min，水洗2次；然后在1%硝酸浸胶5 min，水洗2次；染色液浸胶10 min，水洗3次；加入少许显色液洗胶2次，再加入剩余显色液轻摇直至条带出现，水洗3次；10%乙酸浸胶5～10 min，水洗3次，观察结果；制膜干燥保存。
1.5 结果判断 端粒酶活性阳性标本经PCR扩增形成6核苷酸(5′-TTAGGG-3′)重复片段，在银染的SDS-PAGE凝胶上形成等距离梯形条带图谱。
1.6 数据处理 数据以均数和率表示，采用t检验、秩和检验、四格表确切概率法。
2 结果
2.1 肺组织标本端粒酶活性水平定量分析 30例肺组织标本中，肺癌标本中的端粒酶活性水平明显高于肺良性肿瘤(秩和检验：u＝2.955，0.05
表1 不同肺组织标本的端粒酶活性水平比较
Tab 1 Comparison of telomerase activities of different pulmonary tissues Pulmonary tissues
No. of cases
Range of
A value
Average
A value
Lung cancer
24
1.045-1.153
, http://www.100md.com
0.195
Squamous cell carcinoma
10
0.064-0.456
0.201
Adenocarcinoma
11
0.045-0.227
0.112
Large cell carcinoma
2
0.140-0.146
, 百拇医药
0.143
Small cell carcinoma
1
1.153
Benign neoplasms
6
0.035-0.085
0.058
2.2 肺组织标本端粒酶活性的定性分析 肺癌手术标本的端粒酶阳性检出率为75%(18/24)，其中腺癌的阳性率为54.5%(6/11)，鳞癌的阳性率为90%(9/10)；肺良性肿瘤的端粒酶检出率为0。肺癌TNM分期(依据1987年UICC肺癌的国际分期标准确定)与端粒酶的关系见表2，由于病例数少，未进行统计学处理。但可以看出，原发肿瘤越大、病期越晚，端粒酶阳性率有相对增加的趋势。表2 肺癌病理生理特征与端粒酶的关系
, 百拇医药
Tab 2 Relation between telomerase and pathophysiological
characteristics of lung cancer Characteristics
No. of cases
No. of positive cases
Positive rate
Tumor size
T1
2
1
50%
, http://www.100md.com
T2
11
7
63.6%
T3
11
10
90.9%
Lymph node metastasis
N0
5
4
80%
, 百拇医药
N1
12
8
66.7%
N2
3
2
66.7%
N3
4
4
100%
Stage
, http://www.100md.com Ⅰ
1
1
100%
Ⅱ
10
5
50%
Ⅲ
13
12
92.3%
3 讨论
端粒酶存在于大部分肿瘤细胞中，正常体细胞检测不到端粒酶活性。端粒酶活化是细胞永生性的必须途径，而获得永生是肿瘤恶变的重要一步。因此有学者提出了恶性肿瘤发生的端粒酶理论，认为端粒酶的激活是恶性肿瘤发生学上的一个共同途径，而端粒酶则是各种肿瘤细胞的一个共同的标志物[1，2]。
, 百拇医药
肺癌是一种很普遍的致命的恶性肿瘤，其发病率在20世纪以来已大为提高。Hiyama等人在研究肺癌与端粒酶的关系时发现80.1%的肺癌显示端粒酶激活，其中小细胞肺癌为100%，非小细胞肺癌为72.9%～81.8%[4]。本研究主要检测非小细胞肺癌端粒酶活性。23例患者中17例为端粒酶阳性，占73.9%，与报道相符，而6例肺良性肿瘤中均未检测到端粒酶活性。
Yashima等的研究发现，在肺鳞状细胞癌的发病机理中，很早即可发生支气管上皮出现端粒酶不规则表达；而在腺癌中，端粒酶活化是一个晚期或偶发事件[5]。在我们的实验中腺癌的端粒酶阳性率为54.5%(6/11)，鳞癌的阳性率为90%(9/10)，两者之间差别没有显著性。这可能与本组样本量较小，病例数较少有关。但是腺癌端粒酶活性水平(0.112)显著低于鳞癌(0.201)，差别有显著性(P<0.05)。
另有研究表明，手术分期较晚患者的端粒酶阳性率有相对增加的趋势。原发性非小细胞肺癌中，高水平端粒酶激活常见于具有高细胞增殖率的标本，且端粒酶激活在晚期疾病中的表达水平较早期要高得多[6]。本组病例数小，不能肯定端粒酶的表达与患者肿瘤大小和淋巴结移情况有关，但随着肿瘤进展，其端粒酶阳性率有相对增加的趋势。端粒酶活性在晚期癌变中的表达高于早期癌变，提示端粒酶表达水平的高低可能与肿瘤细胞侵袭，肿瘤进展和转移潜能相关。临床有高效端粒酶激活的非小细胞肺癌患者比端粒酶阴性患者的预后更差。因而端粒酶活性的检测有可能成为判断预后的指标。
, http://www.100md.com
综上，本研究结果初步显示端粒酶活性检测可能是预测肺癌的发生、发展及预后的有效方法，临床上由此可能会派生出以端粒酶为靶点的治疗肺癌的药物或肺癌的基因治疗方法。
本研究受湖北省自然科学基金(SJ96J070)资助
参 考 文 献
1，Seachrist L. Telomeres draw a crawd at Toronto cancer meeting. Science,1995,268(1)∶29-30.
2，Greider CW, Blackburn EH. Telomeres, telomerase and cancer. Scientific Am,1996,274(1)∶92-97.
3，张行，杨骅，程浩，等.端粒酶活性检测的临床应用.中国实验诊断学，1997，1(3)∶26-28.
, 百拇医药
4，Hiyama K, Hiyama E, Ishioka S, et al. Telomerase activity in small cell and non-small cell lung cancers. J Natl Cancer Inst,1995,87(6)∶895-902.
5，Yashima K, Litzky LA, Kaisar L, et al. Telomerase expression in respiratory epithelium during the multistage pathogenesis of lung carcinomas. Cancer Res,1997,57(12)∶2373-2377.
6，Shay JW, Gazdar AF. Telomerase in the early detection of cancer. J Clin Pathol,1997,50(1)∶106-109.
(收稿：2000-01-25 修回：2000-04-10), http://www.100md.com