新型基因转移系统介导p21基因治疗人脑胶质瘤的体外研究
作者：柳湘 韩俊松 田培坤 顾健人
单位：柳湘 韩俊松 田培坤 顾健人(上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室 上海 200032)
关键词：表皮生长因子受体；脑胶质瘤；靶向性非病毒载体；p21基因；细胞凋亡
中国肿瘤生物治疗杂志000104 摘 要 目的: 探索靶向性非病毒载体系统在人脑胶质瘤基因治疗中的应用。方法: 组建了EGF-R介导的GE7基因转移系统，分别与β-gal报道基因和p21基因构成载体复合物，体外转染U251细胞，通过X-gal染色、Western blot分析、原位末端标记、DNA梯带检测等，观察了外源基因的导入及对肿瘤细胞的抑制作用。结果: X-gal染色表明，外源基因的导入率可达80%；转染p21基因后，细胞生长受到明显抑制，第7天生长抑制率约58%。原位末端标记及DNA梯带检测发现，转染细胞有明显的凋亡发生。结论: GE7载体系统能高效靶向地将外源基因导入肿瘤细胞，外源基因的表达可明显抑制肿瘤细胞的生长，有效诱导其凋亡。
, http://www.100md.com
《中国图书资料分类法》分类号 R735.7
In vitro Inhibitory Effect on Growth of Human Glioma Cells with p21 Gene Mediated by a Novel Gene Delivery System
Liuxiang, Han Junsong, Tian Peikun, Gu Jianren
(National Laboratory for Oncogenes & Related Genes, Shanghai Cancer Institute, Shanghai 200032)
Abstract Objective: To investigate the effects of novel targeted non-viral vector in gene therapy of human glioma. Methods: The EGF-R targeting gene delivery system GE7 was constructed. Human glioma cell line U251 was transfected in vitro with β-gal as reportor gene and p21 as therapeutic gene using this gene delivery system. By means of the assay of β-galactosidase staining, Western blotting, in situ end labeling apoptosis cells and DNA ladder, the transferring of exogenous genes and the apoptosis of the tumor cells were examined. Results: It was showed that gene transfer efficiency is over 80%. When transfected with p21 gene, the growth of cells was inhibited significantly, and the apoptosis was detected in the transfected cell by the methods of in situ end labeling and DNA ladder. Conclusion: The GE7 gene delivery system has the ability to transfer exogenous gene to tumor cells and the expression of the therapeutic gene can inhibit the growth of the cells.
, 百拇医药
Key words EGF-Receptor; glioma; targeted non-viral vector; p21WAF-1; apoptosis
脑胶质瘤是神经系统中发病率最高的肿瘤，由于肿瘤呈浸润性生长，手术难以探到功能区和脑深部，病人复发率高。寻找有效的治疗方案是脑恶性胶母细胞瘤的重要课题。尽管近年对应用免疫疗法和细胞因子等基因治疗给予了一定评价，但恶性脑胶质瘤病人总的预后没有明显改善。为克服目前基因治疗存在的载体系统效率低下，无靶向性的缺点，针对脑胶质瘤细胞多伴有表皮生长因子受体(EGF-R)的过度表达[1]，本研究室组建了GE7受体介导的靶向性非病毒载体系统，以p21作为肿瘤细胞凋亡的诱导基因，构成转移复合体，经体外实验观察并证实了载体系统介导的肿瘤抑制效应。此项工作有可能为今后部分脑胶质瘤的治疗开辟一条新途径。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 主要试剂
硫氰酸胍(SPDP)为Serva产品。二硫苏糖醇(DTT)、X-gal、多聚赖氨酸(Polylysine MW29 000)均为Sigma产品。In Situ Cell Death Detection Kit (AP) 购于Boehrngerg 公司。抗人p21抗体购于Oncogene 公司。DAB染色试剂盒购于华美生物工程公司。
1.2 菌株、质粒和细胞
E.coli DH5α由本室保存。pCEP-β-gal, pCEP由本室构建，pCEP-21由Dr. Bert Vogelstein惠赠。U251人脑胶质瘤细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所。DMEM为GIBCO产品。
1.3 基因导入系统的构建[2]
, 百拇医药 1.3.1 根据EGF功能域设计的GE7 16肽及流感病毒血凝素N端20肽HA20由本实验室合成。
1.3.2 GE7-Polylysine，HA20-Polylysine的合成
GE7，HA20，Polylysine与SPDP分别按1∶5的摩尔比，25℃反应2 h。Polylysine-PDP溶液与过量DTT反应。巯基化的Polylysine以1∶3摩尔比，分别与GE7-PDP, HA20-PDP在25℃反应24 h，反应完毕后产物透析、干燥。
1.3.3 多肽/DNA四元复合体的制备
调整pCEP-β-gal，pCEP及pCEP-21 3种DNA的浓度为0.2 μg/μl。将GE7-Polylysine与HA20-Polylysine等量混合，以1∶1的质量比缓慢加至DNA溶液中，25℃反应30 min，1%琼脂糖凝胶电泳观察DNA阻滞情况。
, 百拇医药
1.4 β-gal基因导入实验
U251人脑胶质瘤细胞按2×104/孔密度接种6孔板。去培养液，加入含GE7-POLY/β-gal/POLY-HA20复合体的转染液，其中DNA的浓度2 μg/ml DMEM，37℃,5%CO2培养，24 h后更换完全培液，之后每24 h检测细胞β-gal基因的表达情况。对照组分别为单纯DNA组及PBS组。
1.5 β-gal组织化学染色[3]
转染后的细胞用PBS(pH7.4)洗2次，甲醛-戊二醛4℃固定15 min，PBS(pH7.4)洗3次。加入X-gal反应液(5 mmol/L铁氰化钾、5 mmol/L亚铁氰化钾、2 mmol/L MgCl2、1 mg/ml X-gal)，37℃反应过夜。光镜下观察变蓝细胞数，不同视野观察计算导入率。
, 百拇医药
1.6 p21基因有效实验
消化细胞，以1.5×103/孔的细胞密度接种96孔板。细胞分4组：GE7-POLY-HA20组、GE7-POLY/pCEP/POLY-HA20组、GE7-POLY/pCEP-21/POLY-HA20组及对照组。待细胞满度达40%～50%，更换成含相应复合体的转染液，每组DNA的终浓度为2 μg/ml，对照组以PBS代替，24 h后去转染液。
1.6.1 Western blot 检测p21的表达
操作按文献[4]进行。收集转染72～96 h的细胞，转膜后的蛋白经封闭，预杂交、杂交后用DAB显色，蛋白分子量Maker用氨基黑染色。
1.6.2 细胞生长曲线的观察
每24 h胰酶消化细胞,台盼蓝染色计数活细胞数目，每个样本3孔，每孔计数3次，取平均值作生长曲线。
, 百拇医药
1.6.3 DNA电泳梯带检测
收集转染96 h的细胞，培养细胞DNA的抽提参照Molecular cloning[4]。纯化后的DNA于1.5%的琼脂糖凝胶中电泳3 h。
1.6.4 原位末端标记凋亡细胞
细胞转染96 h，凋亡检测按In Situ Cell Death Detection Kit (AP) 程序操作。
1.7 统计学处理
所有资料均使用SPSS软件进行One-way方差分析，两组之间比较采用t检验。
2 结 果
2.1 GE7，HA20-Polylysine共价连接物与DNA在低离子强度，近中性pH值条件下，可以通过静电作用形成复合体，以1∶1比例将两者混合反应后，1%琼脂糖凝胶电泳阻抑实验证实复合体的形成。图1可见，对照DNA在电泳中呈正常泳动行为，而与多肽反应的DNA则由于复合体的形成被完全阻滞在点样孔中。
, 百拇医药
图1 DNA阻滞电泳结果
Fig. 1 DNA retardation of 4-element complex
1:λDNA/HindⅢ Maker; 2: Plasmid DNA; 3:GE7/Poly-lysine/
HA20/pCEP-β-gal; 4: GE7/Poly-lysine/HA20/pCEP-21;
5: GE7/Poly-lysine/HA20/pCEP
2.2 基因导入实验
体外培养的人脑胶质瘤细胞U251经GE7-POLY/β-gal/POLY-HA20四元复合物转染，X-gal染色表明，转染24 h的细胞即有少量外源基因的表达，72～96 h达高峰，第7天后基本消失。而单纯DNA和PBS组则未见外源基因的导入(见图2)。
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2.3 p21基因有效实验
2.3.1 p21基因在U251细胞中的表达
收集转染96 h的U251细胞，与抗人p21单克隆抗体进行Western blot 检测，结果显示，在约21 kD处有一明显条带，而对照组则无此表达条带(图3)。
2.3.2 U251细胞生长曲线观察
GE7-p21四元复合物转染U251细胞，不同时间消化细胞计数。由细胞生长曲线可以看出，与3组对照组相比，p21转染组细胞生长缓慢，第7天抑制率为58%，表明p21对肿瘤细胞的生长有显著的抑制效应(图4)。
图2 β-半乳糖苷酶染色分析
, 百拇医药
Fig. 2 β-galactosidase assay in vitro
1: Human glioma cell U251 transfected with PBS as control; 2: Human glioma cell U251 transfected with plasmid DNA β-gal as control; 3: Human glioma cell U251 transfected with GE7/Poly-lysine/HA20/pCEP-β-gal
图3 Western blot检测p21的表达
Fig. 3 Western blot analysis of the expression of p21 gene
, 百拇医药
1： Protein marker; 2: U251 cells transfected with GE7/Poly-
lysine/HA20/p21; 3： U251 cells treated as control
图4 U251细胞生长曲线
Fig. 4 U251 cell growth curve
2.3.3 DNA电泳梯带
图5可见，转染p21基因96 h后抽提细胞DNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳显示DNA出现梯带，表明肿瘤细胞中有凋亡的发生。
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图5 DNA电泳梯带
Fig. 5 DNA ladder pattern
1: λDNA/HindⅢ marker; 2: DNA extracted from U251 cells mock-transfectants; 3: DNA extracted from U251 cells 96 hours after transfected with GE7/Poly-lysine/HA20/pCEP-21; 4: pGEM-7Zf (+)/HaeⅢ markers
2.3.4 原位末端标记
结果显示，转染p21组的细胞与对照相比凋亡发生率明显增高(图6)，其凋亡百分率达20%。
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图6 原位末端标记凋亡细胞
Fig. 6 In situ end labeling apoptosis cells
1:Mock-transfectants; 2:GE7/Poly-lysine/HA20/pCEP-21 transfectants
3 讨 论
基因治疗在全世界范围内已有多种治疗方案进入临床，但疗效尚不能令人满意，主要是缺乏一种高效、靶向的载体系统[5]。本研究首次开发了受体介导的基因转移系统，其作用原理是利用细胞表面的受体可以特异性识别相应配体并将其内吞的机理，将与配体结合的外源DNA靶向转移至特定受体表达的细胞。
鉴于多种肿瘤细胞表面存在EGF-R的过度表达[6]，实验中设计合成了针对EGF-R的16肽GE7，同时合成了流感病毒血凝素N端20个多肽HA20，用来防止内吞小泡释放的内容物被溶酶体酶系所降解[7]。GE7和HA20经化学偶联剂SPDP的作用分别与多聚赖氨酸连接，籍Polylysine的阳离子与外源DNA的阴离子形成静电结合的四元复合体，构成了一种以肿瘤细胞表面受体为靶向的基因导入体系，它具有高效、靶向、安全、可同时携带多种基因等特点。有文献报道，多数脑恶性胶质瘤细胞有EGF-R的高表达[1]，因此研究中使用GE7系统，观察其在恶性人脑胶质瘤治疗中的作用。由于EGF-R不仅在肿瘤细胞的表面有表达，也在一些正常组织中表达[8]，因此在选择治疗基因时，避开了使用直接引起细胞死亡的基因，而选用细胞周期抑制基因，此类基因对正常分裂细胞可将细胞周期阻断在G0期，而不引起细胞死亡，但对肿瘤细胞则将诱导其凋亡[9]。本研究首先以β-gal基因作为报道基因观察了GE7系统对U251人脑胶质瘤细胞的转导效率，转染细胞经X-gal染色结果表明，外源基因在24 h即有表达，72～96 h达高峰后逐渐减少至消失，然而单纯DNA组则未见有导入，显示该系统能靶向、高效地转移外源基因进入富于受体表达的U251细胞。用p21基因转染细胞后，Western blot 证实了细胞中有p21的表达；细胞生长曲线观察到转染p21基因组的细胞与其它对照组相比，生长明显受到抑制，其第7天生长抑制率达58%(P<0.01)，3组对照组之间细胞增长无显著差异(P>0.05)。通过进一步对转染细胞进行原位末端标记、DNA电泳梯带等凋亡检测，结果均证实转染p21基因的细胞中有明显凋亡发生。
, 百拇医药
GE7系统是受体介导的基因转移系统的一种探索，由于肿瘤发生造成了细胞膜表面多种受体的异常表达，使该转移系统具有远大的应用前景，根据不同的受体，设计合成不同的靶向配体，可以扩大基因治疗的瘤谱，不仅在脑胶质瘤的治疗中发挥作用，更有望使基因治疗成为手术和放化疗的重要补充。
参 考 文 献
1，Kruse CA, Mitchell DH, Franflin WA, et al. Characterization of continuous human glioma cell line DBTRG-05MG: Growth kinetics, karyotype, receptor expression, and tumor suppressor gene analyses. In Vitro Cell Dev Biol, 1992, 28A(9～10): 609
2，Carlsson J, Drevin H, Axen R. Protein thiolation and reversible protein-protein conjugation. Biochem J, 1978, 173(3): 723
, 百拇医药
3，Xu L, Pirollo KF, Chang EH. Transferrin-lipsome-mediated p53 sensitization of squamous cell carcinoma of the head and neck to radiation in vitro. Hum Gene Ther, 1997, 8(4): 467
4，Sambrook J, Fritisch EF, Maniatis T. Molecular cloning, 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Press, 1989
5，顾健人. 基因治疗的昨天、今天与明天. 中国肿瘤生物治疗杂志，1997， 4(3): 175
6，Wrann M, Fox CF. Identification of epidermal growth factor receptor in a hyperproducing human epidermoid carcinoma cell line. J Biol Chem, 1979, 254: 8083
, 百拇医药
7，Midoux P. Specific gene transfer mediated by lactosylated poly-L-lysine into hepatoma cells. Nucleic Acids Res, 1993, 21(4): 871
8，田培坤, 任圣俊, 任常春, 等. 一种新的以细胞表面受体为靶向的基因导入系统. 中国科学(C辑), 1999, 28(6): 554
9，桂建芳. RNA加工与细胞周期调控. 北京： 科学出版社，1998. 136
(1999-07-22收稿； 1999-12-10修回, 百拇医药
单位：柳湘 韩俊松 田培坤 顾健人(上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室 上海 200032)
关键词：表皮生长因子受体；脑胶质瘤；靶向性非病毒载体；p21基因；细胞凋亡
中国肿瘤生物治疗杂志000104 摘 要 目的: 探索靶向性非病毒载体系统在人脑胶质瘤基因治疗中的应用。方法: 组建了EGF-R介导的GE7基因转移系统，分别与β-gal报道基因和p21基因构成载体复合物，体外转染U251细胞，通过X-gal染色、Western blot分析、原位末端标记、DNA梯带检测等，观察了外源基因的导入及对肿瘤细胞的抑制作用。结果: X-gal染色表明，外源基因的导入率可达80%；转染p21基因后，细胞生长受到明显抑制，第7天生长抑制率约58%。原位末端标记及DNA梯带检测发现，转染细胞有明显的凋亡发生。结论: GE7载体系统能高效靶向地将外源基因导入肿瘤细胞，外源基因的表达可明显抑制肿瘤细胞的生长，有效诱导其凋亡。
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《中国图书资料分类法》分类号 R735.7
In vitro Inhibitory Effect on Growth of Human Glioma Cells with p21 Gene Mediated by a Novel Gene Delivery System
Liuxiang, Han Junsong, Tian Peikun, Gu Jianren
(National Laboratory for Oncogenes & Related Genes, Shanghai Cancer Institute, Shanghai 200032)
Abstract Objective: To investigate the effects of novel targeted non-viral vector in gene therapy of human glioma. Methods: The EGF-R targeting gene delivery system GE7 was constructed. Human glioma cell line U251 was transfected in vitro with β-gal as reportor gene and p21 as therapeutic gene using this gene delivery system. By means of the assay of β-galactosidase staining, Western blotting, in situ end labeling apoptosis cells and DNA ladder, the transferring of exogenous genes and the apoptosis of the tumor cells were examined. Results: It was showed that gene transfer efficiency is over 80%. When transfected with p21 gene, the growth of cells was inhibited significantly, and the apoptosis was detected in the transfected cell by the methods of in situ end labeling and DNA ladder. Conclusion: The GE7 gene delivery system has the ability to transfer exogenous gene to tumor cells and the expression of the therapeutic gene can inhibit the growth of the cells.
, 百拇医药
Key words EGF-Receptor; glioma; targeted non-viral vector; p21WAF-1; apoptosis
脑胶质瘤是神经系统中发病率最高的肿瘤，由于肿瘤呈浸润性生长，手术难以探到功能区和脑深部，病人复发率高。寻找有效的治疗方案是脑恶性胶母细胞瘤的重要课题。尽管近年对应用免疫疗法和细胞因子等基因治疗给予了一定评价，但恶性脑胶质瘤病人总的预后没有明显改善。为克服目前基因治疗存在的载体系统效率低下，无靶向性的缺点，针对脑胶质瘤细胞多伴有表皮生长因子受体(EGF-R)的过度表达[1]，本研究室组建了GE7受体介导的靶向性非病毒载体系统，以p21作为肿瘤细胞凋亡的诱导基因，构成转移复合体，经体外实验观察并证实了载体系统介导的肿瘤抑制效应。此项工作有可能为今后部分脑胶质瘤的治疗开辟一条新途径。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 主要试剂
硫氰酸胍(SPDP)为Serva产品。二硫苏糖醇(DTT)、X-gal、多聚赖氨酸(Polylysine MW29 000)均为Sigma产品。In Situ Cell Death Detection Kit (AP) 购于Boehrngerg 公司。抗人p21抗体购于Oncogene 公司。DAB染色试剂盒购于华美生物工程公司。
1.2 菌株、质粒和细胞
E.coli DH5α由本室保存。pCEP-β-gal, pCEP由本室构建，pCEP-21由Dr. Bert Vogelstein惠赠。U251人脑胶质瘤细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所。DMEM为GIBCO产品。
1.3 基因导入系统的构建[2]
, 百拇医药 1.3.1 根据EGF功能域设计的GE7 16肽及流感病毒血凝素N端20肽HA20由本实验室合成。
1.3.2 GE7-Polylysine，HA20-Polylysine的合成
GE7，HA20，Polylysine与SPDP分别按1∶5的摩尔比，25℃反应2 h。Polylysine-PDP溶液与过量DTT反应。巯基化的Polylysine以1∶3摩尔比，分别与GE7-PDP, HA20-PDP在25℃反应24 h，反应完毕后产物透析、干燥。
1.3.3 多肽/DNA四元复合体的制备
调整pCEP-β-gal，pCEP及pCEP-21 3种DNA的浓度为0.2 μg/μl。将GE7-Polylysine与HA20-Polylysine等量混合，以1∶1的质量比缓慢加至DNA溶液中，25℃反应30 min，1%琼脂糖凝胶电泳观察DNA阻滞情况。
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1.4 β-gal基因导入实验
U251人脑胶质瘤细胞按2×104/孔密度接种6孔板。去培养液，加入含GE7-POLY/β-gal/POLY-HA20复合体的转染液，其中DNA的浓度2 μg/ml DMEM，37℃,5%CO2培养，24 h后更换完全培液，之后每24 h检测细胞β-gal基因的表达情况。对照组分别为单纯DNA组及PBS组。
1.5 β-gal组织化学染色[3]
转染后的细胞用PBS(pH7.4)洗2次，甲醛-戊二醛4℃固定15 min，PBS(pH7.4)洗3次。加入X-gal反应液(5 mmol/L铁氰化钾、5 mmol/L亚铁氰化钾、2 mmol/L MgCl2、1 mg/ml X-gal)，37℃反应过夜。光镜下观察变蓝细胞数，不同视野观察计算导入率。
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1.6 p21基因有效实验
消化细胞，以1.5×103/孔的细胞密度接种96孔板。细胞分4组：GE7-POLY-HA20组、GE7-POLY/pCEP/POLY-HA20组、GE7-POLY/pCEP-21/POLY-HA20组及对照组。待细胞满度达40%～50%，更换成含相应复合体的转染液，每组DNA的终浓度为2 μg/ml，对照组以PBS代替，24 h后去转染液。
1.6.1 Western blot 检测p21的表达
操作按文献[4]进行。收集转染72～96 h的细胞，转膜后的蛋白经封闭，预杂交、杂交后用DAB显色，蛋白分子量Maker用氨基黑染色。
1.6.2 细胞生长曲线的观察
每24 h胰酶消化细胞,台盼蓝染色计数活细胞数目，每个样本3孔，每孔计数3次，取平均值作生长曲线。
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1.6.3 DNA电泳梯带检测
收集转染96 h的细胞，培养细胞DNA的抽提参照Molecular cloning[4]。纯化后的DNA于1.5%的琼脂糖凝胶中电泳3 h。
1.6.4 原位末端标记凋亡细胞
细胞转染96 h，凋亡检测按In Situ Cell Death Detection Kit (AP) 程序操作。
1.7 统计学处理
所有资料均使用SPSS软件进行One-way方差分析，两组之间比较采用t检验。
2 结 果
2.1 GE7，HA20-Polylysine共价连接物与DNA在低离子强度，近中性pH值条件下，可以通过静电作用形成复合体，以1∶1比例将两者混合反应后，1%琼脂糖凝胶电泳阻抑实验证实复合体的形成。图1可见，对照DNA在电泳中呈正常泳动行为，而与多肽反应的DNA则由于复合体的形成被完全阻滞在点样孔中。
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图1 DNA阻滞电泳结果
Fig. 1 DNA retardation of 4-element complex
1:λDNA/HindⅢ Maker; 2: Plasmid DNA; 3:GE7/Poly-lysine/
HA20/pCEP-β-gal; 4: GE7/Poly-lysine/HA20/pCEP-21;
5: GE7/Poly-lysine/HA20/pCEP
2.2 基因导入实验
体外培养的人脑胶质瘤细胞U251经GE7-POLY/β-gal/POLY-HA20四元复合物转染，X-gal染色表明，转染24 h的细胞即有少量外源基因的表达，72～96 h达高峰，第7天后基本消失。而单纯DNA和PBS组则未见外源基因的导入(见图2)。
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2.3 p21基因有效实验
2.3.1 p21基因在U251细胞中的表达
收集转染96 h的U251细胞，与抗人p21单克隆抗体进行Western blot 检测，结果显示，在约21 kD处有一明显条带，而对照组则无此表达条带(图3)。
2.3.2 U251细胞生长曲线观察
GE7-p21四元复合物转染U251细胞，不同时间消化细胞计数。由细胞生长曲线可以看出，与3组对照组相比，p21转染组细胞生长缓慢，第7天抑制率为58%，表明p21对肿瘤细胞的生长有显著的抑制效应(图4)。
图2 β-半乳糖苷酶染色分析
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Fig. 2 β-galactosidase assay in vitro
1: Human glioma cell U251 transfected with PBS as control; 2: Human glioma cell U251 transfected with plasmid DNA β-gal as control; 3: Human glioma cell U251 transfected with GE7/Poly-lysine/HA20/pCEP-β-gal
图3 Western blot检测p21的表达
Fig. 3 Western blot analysis of the expression of p21 gene
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1： Protein marker; 2: U251 cells transfected with GE7/Poly-
lysine/HA20/p21; 3： U251 cells treated as control
图4 U251细胞生长曲线
Fig. 4 U251 cell growth curve
2.3.3 DNA电泳梯带
图5可见，转染p21基因96 h后抽提细胞DNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳显示DNA出现梯带，表明肿瘤细胞中有凋亡的发生。
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图5 DNA电泳梯带
Fig. 5 DNA ladder pattern
1: λDNA/HindⅢ marker; 2: DNA extracted from U251 cells mock-transfectants; 3: DNA extracted from U251 cells 96 hours after transfected with GE7/Poly-lysine/HA20/pCEP-21; 4: pGEM-7Zf (+)/HaeⅢ markers
2.3.4 原位末端标记
结果显示，转染p21组的细胞与对照相比凋亡发生率明显增高(图6)，其凋亡百分率达20%。
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图6 原位末端标记凋亡细胞
Fig. 6 In situ end labeling apoptosis cells
1:Mock-transfectants; 2:GE7/Poly-lysine/HA20/pCEP-21 transfectants
3 讨 论
基因治疗在全世界范围内已有多种治疗方案进入临床，但疗效尚不能令人满意，主要是缺乏一种高效、靶向的载体系统[5]。本研究首次开发了受体介导的基因转移系统，其作用原理是利用细胞表面的受体可以特异性识别相应配体并将其内吞的机理，将与配体结合的外源DNA靶向转移至特定受体表达的细胞。
鉴于多种肿瘤细胞表面存在EGF-R的过度表达[6]，实验中设计合成了针对EGF-R的16肽GE7，同时合成了流感病毒血凝素N端20个多肽HA20，用来防止内吞小泡释放的内容物被溶酶体酶系所降解[7]。GE7和HA20经化学偶联剂SPDP的作用分别与多聚赖氨酸连接，籍Polylysine的阳离子与外源DNA的阴离子形成静电结合的四元复合体，构成了一种以肿瘤细胞表面受体为靶向的基因导入体系，它具有高效、靶向、安全、可同时携带多种基因等特点。有文献报道，多数脑恶性胶质瘤细胞有EGF-R的高表达[1]，因此研究中使用GE7系统，观察其在恶性人脑胶质瘤治疗中的作用。由于EGF-R不仅在肿瘤细胞的表面有表达，也在一些正常组织中表达[8]，因此在选择治疗基因时，避开了使用直接引起细胞死亡的基因，而选用细胞周期抑制基因，此类基因对正常分裂细胞可将细胞周期阻断在G0期，而不引起细胞死亡，但对肿瘤细胞则将诱导其凋亡[9]。本研究首先以β-gal基因作为报道基因观察了GE7系统对U251人脑胶质瘤细胞的转导效率，转染细胞经X-gal染色结果表明，外源基因在24 h即有表达，72～96 h达高峰后逐渐减少至消失，然而单纯DNA组则未见有导入，显示该系统能靶向、高效地转移外源基因进入富于受体表达的U251细胞。用p21基因转染细胞后，Western blot 证实了细胞中有p21的表达；细胞生长曲线观察到转染p21基因组的细胞与其它对照组相比，生长明显受到抑制，其第7天生长抑制率达58%(P<0.01)，3组对照组之间细胞增长无显著差异(P>0.05)。通过进一步对转染细胞进行原位末端标记、DNA电泳梯带等凋亡检测，结果均证实转染p21基因的细胞中有明显凋亡发生。
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GE7系统是受体介导的基因转移系统的一种探索，由于肿瘤发生造成了细胞膜表面多种受体的异常表达，使该转移系统具有远大的应用前景，根据不同的受体，设计合成不同的靶向配体，可以扩大基因治疗的瘤谱，不仅在脑胶质瘤的治疗中发挥作用，更有望使基因治疗成为手术和放化疗的重要补充。
参 考 文 献
1，Kruse CA, Mitchell DH, Franflin WA, et al. Characterization of continuous human glioma cell line DBTRG-05MG: Growth kinetics, karyotype, receptor expression, and tumor suppressor gene analyses. In Vitro Cell Dev Biol, 1992, 28A(9～10): 609
2，Carlsson J, Drevin H, Axen R. Protein thiolation and reversible protein-protein conjugation. Biochem J, 1978, 173(3): 723
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(1999-07-22收稿； 1999-12-10修回, 百拇医药