CH50多肽体内激活巨噬细胞及其抗肿瘤作用研究
作者：冯作化 张桂梅 李东 张慧
单位：冯作化 张桂梅 李东 张慧(同济医科大学医学分子生物学研究室 武汉 430030)
关键词：纤维结合素；重组多肽；γ-干扰素；巨噬细胞；肿瘤
中国肿瘤生物治疗杂志000109 摘 要 目的： 研究重组FN多肽CH50在体内激活巨噬细胞及其抗肿瘤作用的特点。方法： 体内注射CH50和/或转染IFN-γ基因，检测巨噬细胞产生的各种因子，测定荷瘤鼠体内肿瘤生长速度。结果： CH50单独作用可促进巨噬细胞产生NO，TNF，IL-1等因子，但激活作用较慢。注射CH50和转染IFN-γ基因不分先后，均可在体内协同作用，迅速激活巨噬细胞。单独注射CH50能够抑制肿瘤结节的形成，其抑制作用呈剂量依赖关系；低剂量CH50对 <1 mm 的肿瘤结节已有很强的抑制作用，较大剂量时对>1 mm的肿瘤结节也有很强的抑制作用。CH50与IFN-γ在体内的协同作用使其抑制体内肿瘤生长的作用更强。结论： CH50与IFN-γ作为体内巨噬细胞激活的双信号因子在肿瘤治疗中具有极大的应用潜力。
, 百拇医药
《中国图书资料分类法》分类号 Q512.1； R329.2
Effect of Polypeptide CH50 on Macrophage Activation in vivo and Its Antitumor Function
Feng Zuohua, Zhang Guimei, Li Dong, Zhang Hui
(Department of Medical Molecular Biology, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract Objective：To study the main features of CH50, a recombinant polypeptide of human fibronectin, to activate macrophages in vivo and its anti-tumor function. Methods： CH50 was injected and IFN-γ gene was transfected in mice several kinds of factors produced by macrophages were determined. The growth of tumor in mice was also measured. Results： CH50 could enhance the production of such factors as NO, TNF and IL-1 by macrophages, but the activation of macrophages was relatively slow when CH50 was used in vivo alone. CH50 and IFN-γ could synergistically activate macrophages rapidly in vivo no matter whether the injection of CH50 or the transfection of IFN-γ gene was performed first. Injection of CH50 alone inhibited the formation of tumor nodes in a dose-dependent manner. There was strong inhibition of low dosage of CH50 on the formation of tumor nodes smaller than 1 mm, and high dosage of CH50 on those bigger than 1 mm. A stronger inhibition on the growth of tumor in vivo was obtained by the synergistic effect of CH50 and IFN-γ. Conclusion： CH50 and IFN-γ, as double-signal factors for activation of macrophages, will be potentially useful in tumor therapy.
, 百拇医药
Key words fribronectin； recombinant polypeptide； interferon-γ； macrophage； tumor
手术、化疗和放疗是目前肿瘤治疗的主要手段。以手术等治疗方法除去大块肿瘤组织后，对残存肿瘤细胞的抑制和清除则是目前面临的主要难题。如能有效激活巨噬细胞功能，不仅可以较早地对残存的肿瘤细胞产生杀伤和清除作用，而且可为诱导特异性抗肿瘤免疫应答创造条件。重组FN多肽CH50是以基因工程方法将人纤维结合素(fibronectin, FN)的CellⅠ和HepⅡ两个结构域进行重组，在大肠杆菌中表达、制备的一种双结构域重组多肽[1]。该多肽具有抑制肿瘤细胞浸润转移的作用[2]，并能够激活巨噬细胞[3]，有可能为免疫生物治疗创造有利条件。本文研究了CH50多肽在体内激活巨噬细胞的特点及其抗肿瘤作用。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 细胞与动物
小鼠黑色素瘤细胞B16/F1购自美国ATCC公司。艾氏腹水癌细胞、L929细胞为本室保存。16～18 g(雌雄各半)清洁级昆明种小鼠，由本校实验动物中心提供。 C57BL/6小鼠，6至8周龄，购自中国医科院实验动物中心。
1.2 试剂
重组FN多肽CH50按照我们在文献[1]中描述的方法，将携带有CH50表达质粒的工程菌诱导后，超声波裂菌，将可溶性表达产物经离子交换层析和亲和层析两步纯化，得到CH50(分子量59.7 kD)的纯品，纯度>95%，溶于PBS中。
1.3 腹腔巨噬细胞代谢活性与杀伤活性检测
以B16/F1细胞为靶细胞，小鼠腹腔巨噬细胞为效应细胞，效靶比为10∶1，于37℃,5%CO2培养箱中温育，采用间接MTT比色法检测[4]。杀伤后存活靶细胞(即温育后效靶细胞混合孔中存活的靶细胞)的OD值＝巨噬细胞和靶细胞混合孔的OD值-单纯巨噬细胞孔的OD值。以巨噬细胞孔的OD值表示巨噬细胞的代谢活性。
, http://www.100md.com
杀伤活性(%)按下列公式计算:
1.4 巨噬细胞培养上清中各种因子的检测
将小鼠腹腔巨噬细胞以2×106/ml的浓度在96孔培养板中培养48 h。采用比色法测定上清中的NO[3]，结果以 μmol/L表示。采用小鼠胸腺细胞增殖试验检测IL-1活性，以MTT法[5]检测，结果以A570值表示。采用以L929为靶细胞的MTT测定法[5]检测TNF活性，结果按下列公式以细胞毒指数表示：
1.5 小鼠γ-干扰素(IFN-γ)体内基因转染
, 百拇医药
采用改进的磷酸钙介导细胞转染法[6,7]将真核表达质粒pIγ7(带有小鼠IFN-γ全长cDNA的pREP8表达质粒)直接进行小鼠腹腔转染。
1.6 动物实验
将小鼠随机分组，将黑色素瘤B16/F1细胞(1×106/只)接种于C57BL/6小鼠腹腔，接种后10 d解剖小鼠，计数腹腔肿瘤结节数；或将艾氏腹水癌细胞(1×106/只)接种于昆明种小鼠腹腔，接种后9 d解剖小鼠，测定腹水量。
1.7 统计学处理
采用 t 检验。
2 结 果
2.1 CH50多肽单独注射对巨噬细胞的激活作用
, http://www.100md.com
将昆明种小鼠分组后单独注射CH50多肽(腹腔注射，每只小鼠200 μg/次，以后各实验中均为此注射剂量)，对照组注射PBS，各组分别注射1 d, 2 d, 3 d(每天1次)，然后取出巨噬细胞体外培养，检测上清中的NO，NO产生量均很低，检测值均低于 4 μmol/L，与对照组(0.6～2 μmol/L)差异不显著。连续注射5 d，则可产生较多的NO(表1)，同时，从表1其它几项指标看，巨噬细胞的功能被显著激活。
表1 单独注射CH50多肽对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响
Tab. 1 Effect of injection of CH50 alone on the function of macrophages Groups
n
Parameters
, http://www.100md.com Metabolism(A)
NO(μmol/L)
Cytotoxicity(%)
IL-1(A)
TNF-α(%)
Control
7
0.38±0.09
2.1±1.33
28.3±8.7
0.09±0.02
15.3±8.7
, http://www.100md.com
CH50
7
0.55±0.08△
18.67±4.65△
54.5±7.3△
0.26±0.09△
30.3±4.7△
△ P<0.01 compared with control2.2 双信号激活巨噬细胞的作用
将昆明种小鼠体内转染IFN-γ，在转染后不同时间注射1次CH50，注射后6 h取出巨噬细胞体外培养，测NO。在较长时间内(8 d)，巨噬细胞对CH50保持着很高的反应性(图1)。单纯IFN-γ基因转染对巨噬细胞的激活作用在第4天达到高峰，注射CH50，激活作用更强，而且保持同样的峰。
, 百拇医药
腹腔注射1次CH50，第2天体内转染IFN-γ，转染后1 d，取腹腔巨噬细胞培养，也可以有效激活巨噬细胞产生NO(表2)。转染IFN-γ后2 d，注射CH50，6 h后取出巨噬细胞培养，亦可有效激活巨噬细胞产生NO。
将小鼠体内转染IFN-γ基因， 第2天注射1次CH50，进行第1次体内激活。间隔2 d后，再次转染IFN-γ基因，转染后第2天将小鼠分为两组，一组注射PBS，另一组注射CH50，6 h后取出巨噬细胞培养，检测NO的产生，加PBS注射组为2.1±1.2 μmol/L，加CH50注射组则为 16.2±4.1 μmol/L，P<0.01。表明再次转染加CH50注射起到了第2次激活的作用，第2次给予双信号仍可有效激活巨噬细胞，第1次激活的巨噬细胞对再次激活作用不产生抑制。
图1 IFN-γ体内转染后不同时间注射CH50对
, http://www.100md.com
巨噬细胞的激活作用
Fig.1 Activation of macrophages by CH50 injected in different
time after transfection of IFN-γ gene in vivo
2.3 治疗肿瘤的作用
腹腔接种黑色素瘤B16/F1细胞后，以不同剂量腹腔单独注射CH50，连续10 d，能够抑制肿瘤结节的形成，其抑制作用呈剂量依赖关系(图2)。低剂量CH50对 <1 mm 的结节已有很强的抑制作用；剂量加大时，对1～3 mm 和 >3 mm 的肿瘤结节的抑制作用均增强，且作用效果相同。
表2 CH50和IFN-γ在体内先后刺激对巨噬细胞的激活作用
, 百拇医药
Tab. 2 Activation of CH50 and IFN-γ on macrophages
by successive stimulation in vivo Group
n
First
Second
NO(μmol/L)
1
8
PBS
PBS
1.3±0.6
, 百拇医药
2
8
CH50
PBS
2.7±1.3
3
8
CH50
IFN-γ
10.6±2.1△
4
8
IFN-γ
, http://www.100md.com
CH50
19.9±2.7△
5
8
IFN-γ
PBS
3.9±1.2
△P<0.01 compared with group 1
图2 CH50对腹腔接种黑色素瘤后肿瘤结节的抑制作用
Fig. 2 Inhibition of CH50 on the formation of melanoma
, 百拇医药
nodes after inoculation in peritoneal cavity
表3 CH50体内激活巨噬细胞对艾氏腹水瘤和黑色素瘤的抑制作用
Tab. 3 Inhibition of CH50 on Ehrlich ascites carcinoma and melanoma by activating macrophages in vivo
Volume of ascites or number of melanoma nodes
Parameters
Control
IFN-γ
CH50
, http://www.100md.com
IFN-γ+CH50
Ehrlich (n=9)
ascites (ml)
3.5±0.7
3.2±0.6
3.3±0.6
0.6±0.8▲
Melanoma(n=8)
nodes <1 mm
137.4±24.1
54.2±15.6▲
, 百拇医药
13.8±7.3▲
21.8±9.1△
nodes >1 mm
46.1±11.7
31.8±11.1△
23.8±6.3▲
5.2±3.5▲
total nodes
183.5±24.6
86.2±22.1▲
, 百拇医药
37.6±2.7▲
27.6±8.7▲
▲ P<0.01 compared with control； △ P<0.05 小鼠腹腔接种黑色素瘤B16/F1或艾氏腹水癌后，对照组注射PBS，治疗组分别以3种方案治疗：① 接种后1，4，7 d体内转染IFN-γ基因；② 接种后注射CH50，每天1次，连续8 d，③ 转染基因和注射CH50同时进行，方案同前2组。从表3可见，IFN-γ转染和注射CH50单独对艾氏腹水癌的治疗作用都很弱，协同作用时才能有效抑制艾氏腹水癌的生长；而对黑色素瘤，两者都有治疗作用，CH50对小结节的抑制作用明显比IFN-γ强，而两者协同作用时主要是对较大的肿瘤结节产生更强的抑制作用。
3 讨 论
我们前面的研究工作[2,3]已经证明，CH50可以抑制肿瘤细胞的浸润能力，能够激活巨噬细胞的杀瘤功能，与IFN-γ有协同激活巨噬细胞以及在体内抑制肿瘤细胞生长的作用。本文研究工作进一步探讨了CH50在体内激活巨噬细胞以及抑制肿瘤生长的特点。CH50不仅可以在体外有效激活巨噬细胞[3]，在体内同样可以有效地激活巨噬细胞。但CH50单独作用时，激活巨噬细胞需要一段较长的时间，而在有IFN-γ存在的情况下，CH50在体内激活巨噬细胞的作用则非常迅速，体内作用6 h，即可有效地激活巨噬细胞。
, http://www.100md.com
小鼠体内转染IFN-γ基因后，对巨噬细胞的激活作用在第4天达到高峰，注射CH50，激活作用更强，而且保持同样的峰。这进一步证明了CH50和IFN-γ协同激活巨噬细胞的作用。有IFN-γ存在时，巨噬细胞对CH50可以产生更强的反应，IFN-γ的作用越强，CH50的作用亦越强。体内转染IFN-γ可以使巨噬细胞在较长时间内对CH50保持较好的反应性。
巨噬细胞需要双信号的作用才能充分激活[7]。没有适当的双信号,不能充分激活巨噬细胞介导的肿瘤细胞毒(MTC)功能。 对巨噬细胞激活双信号的研究虽然很多, 但目前仍没有适合肿瘤治疗用的双信号因子，另一方面, 在双信号激活中与IFN-γ协同作用的因子(如LPS,TNF等), 如果先于IFN-γ作用于巨噬细胞, 容易引起巨噬细胞的免疫耐受，抑制MTC功能的充分激活[8]， 在肿瘤治疗中很难控制。研究结果表明，CH50和IFN-γ在体内协同作用激活巨噬细胞时，作用不分先后，而且可以达到重复激活的效果，先激活的巨噬细胞亦未抑制以后对巨噬细胞的激活作用。这种重复激活巨噬细胞的特点使得CH50和IFN-γ有希望成为适合于临床治疗肿瘤用的巨噬细胞激活双信号因子。
, 百拇医药
CH50和IFN-γ单独作用，都可抑制实体瘤的生长，对腹水癌细胞的抑制作用则较弱，协同作用时则有很强的抑制作用。表明对于体内游离生长的癌细胞(如白血病细胞，通过血液转移的癌细胞等)，须充分激活巨噬细胞才能对其产生有效的杀伤作用。同时表明，以CH50和IFN-γ双信号激活巨噬细胞，在白血病缓解期继续杀伤体内残存的癌细胞，可能具有较好的应用前景。
参 考 文 献
1，张桂梅, 冯作化, 李 东, 等. 双功能结构域重组FN多肽表达质粒的构建及其表达产物的功能. 生物工程学报， 1996， 12(suppl): 121
2，张桂梅, 冯作化, 张 慧, 等. 双功能域重组FN 多肽抑制癌细胞浸润能力的研究. 同济医科大学学报， 1998， 27(1): 6
3，冯作化， 张桂梅， 张 慧， 等. 重组FN多肽CH50对巨噬细胞抗肿瘤功能的促进作用. 中国免疫学杂， 1998， 14(4)： 268
, http://www.100md.com
4，Jiao H, Shen W, Ohe Y， et al. A new MTT assay for testing macrophage cytotoxicity to L1210 and its drug-resistant cell lines in vitro. Cancer Immunol Immunother, 1992， 35: 412
5，Mosman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assay. J Immunol Methods， 1983， 65(1～2): 55
6，萨姆布鲁克 J，弗里奇 EF，曼尼阿蒂斯蒂 T. 分子克隆实验指南. 金冬雁， 黎孟枫等译. 第2版. 北京： 科学出版社， 1992. 792
7，周 滨, 姜志尧, 张桂梅， 等. 体内IFN-γ基因转染小鼠腹腔巨噬细胞抗肿瘤作用的研究. 中国免疫学杂志， 1998， 14(1): 22
8，刘 彦. 巨噬细胞的激活与其信息传递. 国外医学免疫学分册， 1996， (4): 214
(1999-03-30收稿； 1999-04-15修回), 百拇医药
单位：冯作化 张桂梅 李东 张慧(同济医科大学医学分子生物学研究室 武汉 430030)
关键词：纤维结合素；重组多肽；γ-干扰素；巨噬细胞；肿瘤
中国肿瘤生物治疗杂志000109 摘 要 目的： 研究重组FN多肽CH50在体内激活巨噬细胞及其抗肿瘤作用的特点。方法： 体内注射CH50和/或转染IFN-γ基因，检测巨噬细胞产生的各种因子，测定荷瘤鼠体内肿瘤生长速度。结果： CH50单独作用可促进巨噬细胞产生NO，TNF，IL-1等因子，但激活作用较慢。注射CH50和转染IFN-γ基因不分先后，均可在体内协同作用，迅速激活巨噬细胞。单独注射CH50能够抑制肿瘤结节的形成，其抑制作用呈剂量依赖关系；低剂量CH50对 <1 mm 的肿瘤结节已有很强的抑制作用，较大剂量时对>1 mm的肿瘤结节也有很强的抑制作用。CH50与IFN-γ在体内的协同作用使其抑制体内肿瘤生长的作用更强。结论： CH50与IFN-γ作为体内巨噬细胞激活的双信号因子在肿瘤治疗中具有极大的应用潜力。
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《中国图书资料分类法》分类号 Q512.1； R329.2
Effect of Polypeptide CH50 on Macrophage Activation in vivo and Its Antitumor Function
Feng Zuohua, Zhang Guimei, Li Dong, Zhang Hui
(Department of Medical Molecular Biology, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract Objective：To study the main features of CH50, a recombinant polypeptide of human fibronectin, to activate macrophages in vivo and its anti-tumor function. Methods： CH50 was injected and IFN-γ gene was transfected in mice several kinds of factors produced by macrophages were determined. The growth of tumor in mice was also measured. Results： CH50 could enhance the production of such factors as NO, TNF and IL-1 by macrophages, but the activation of macrophages was relatively slow when CH50 was used in vivo alone. CH50 and IFN-γ could synergistically activate macrophages rapidly in vivo no matter whether the injection of CH50 or the transfection of IFN-γ gene was performed first. Injection of CH50 alone inhibited the formation of tumor nodes in a dose-dependent manner. There was strong inhibition of low dosage of CH50 on the formation of tumor nodes smaller than 1 mm, and high dosage of CH50 on those bigger than 1 mm. A stronger inhibition on the growth of tumor in vivo was obtained by the synergistic effect of CH50 and IFN-γ. Conclusion： CH50 and IFN-γ, as double-signal factors for activation of macrophages, will be potentially useful in tumor therapy.
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Key words fribronectin； recombinant polypeptide； interferon-γ； macrophage； tumor
手术、化疗和放疗是目前肿瘤治疗的主要手段。以手术等治疗方法除去大块肿瘤组织后，对残存肿瘤细胞的抑制和清除则是目前面临的主要难题。如能有效激活巨噬细胞功能，不仅可以较早地对残存的肿瘤细胞产生杀伤和清除作用，而且可为诱导特异性抗肿瘤免疫应答创造条件。重组FN多肽CH50是以基因工程方法将人纤维结合素(fibronectin, FN)的CellⅠ和HepⅡ两个结构域进行重组，在大肠杆菌中表达、制备的一种双结构域重组多肽[1]。该多肽具有抑制肿瘤细胞浸润转移的作用[2]，并能够激活巨噬细胞[3]，有可能为免疫生物治疗创造有利条件。本文研究了CH50多肽在体内激活巨噬细胞的特点及其抗肿瘤作用。
1 材料与方法
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1.1 细胞与动物
小鼠黑色素瘤细胞B16/F1购自美国ATCC公司。艾氏腹水癌细胞、L929细胞为本室保存。16～18 g(雌雄各半)清洁级昆明种小鼠，由本校实验动物中心提供。 C57BL/6小鼠，6至8周龄，购自中国医科院实验动物中心。
1.2 试剂
重组FN多肽CH50按照我们在文献[1]中描述的方法，将携带有CH50表达质粒的工程菌诱导后，超声波裂菌，将可溶性表达产物经离子交换层析和亲和层析两步纯化，得到CH50(分子量59.7 kD)的纯品，纯度>95%，溶于PBS中。
1.3 腹腔巨噬细胞代谢活性与杀伤活性检测
以B16/F1细胞为靶细胞，小鼠腹腔巨噬细胞为效应细胞，效靶比为10∶1，于37℃,5%CO2培养箱中温育，采用间接MTT比色法检测[4]。杀伤后存活靶细胞(即温育后效靶细胞混合孔中存活的靶细胞)的OD值＝巨噬细胞和靶细胞混合孔的OD值-单纯巨噬细胞孔的OD值。以巨噬细胞孔的OD值表示巨噬细胞的代谢活性。
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杀伤活性(%)按下列公式计算:
1.4 巨噬细胞培养上清中各种因子的检测
将小鼠腹腔巨噬细胞以2×106/ml的浓度在96孔培养板中培养48 h。采用比色法测定上清中的NO[3]，结果以 μmol/L表示。采用小鼠胸腺细胞增殖试验检测IL-1活性，以MTT法[5]检测，结果以A570值表示。采用以L929为靶细胞的MTT测定法[5]检测TNF活性，结果按下列公式以细胞毒指数表示：
1.5 小鼠γ-干扰素(IFN-γ)体内基因转染
, 百拇医药
采用改进的磷酸钙介导细胞转染法[6,7]将真核表达质粒pIγ7(带有小鼠IFN-γ全长cDNA的pREP8表达质粒)直接进行小鼠腹腔转染。
1.6 动物实验
将小鼠随机分组，将黑色素瘤B16/F1细胞(1×106/只)接种于C57BL/6小鼠腹腔，接种后10 d解剖小鼠，计数腹腔肿瘤结节数；或将艾氏腹水癌细胞(1×106/只)接种于昆明种小鼠腹腔，接种后9 d解剖小鼠，测定腹水量。
1.7 统计学处理
采用 t 检验。
2 结 果
2.1 CH50多肽单独注射对巨噬细胞的激活作用
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将昆明种小鼠分组后单独注射CH50多肽(腹腔注射，每只小鼠200 μg/次，以后各实验中均为此注射剂量)，对照组注射PBS，各组分别注射1 d, 2 d, 3 d(每天1次)，然后取出巨噬细胞体外培养，检测上清中的NO，NO产生量均很低，检测值均低于 4 μmol/L，与对照组(0.6～2 μmol/L)差异不显著。连续注射5 d，则可产生较多的NO(表1)，同时，从表1其它几项指标看，巨噬细胞的功能被显著激活。
表1 单独注射CH50多肽对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响
Tab. 1 Effect of injection of CH50 alone on the function of macrophages Groups
n
Parameters
, http://www.100md.com Metabolism(A)
NO(μmol/L)
Cytotoxicity(%)
IL-1(A)
TNF-α(%)
Control
7
0.38±0.09
2.1±1.33
28.3±8.7
0.09±0.02
15.3±8.7
, http://www.100md.com
CH50
7
0.55±0.08△
18.67±4.65△
54.5±7.3△
0.26±0.09△
30.3±4.7△
△ P<0.01 compared with control2.2 双信号激活巨噬细胞的作用
将昆明种小鼠体内转染IFN-γ，在转染后不同时间注射1次CH50，注射后6 h取出巨噬细胞体外培养，测NO。在较长时间内(8 d)，巨噬细胞对CH50保持着很高的反应性(图1)。单纯IFN-γ基因转染对巨噬细胞的激活作用在第4天达到高峰，注射CH50，激活作用更强，而且保持同样的峰。
, 百拇医药
腹腔注射1次CH50，第2天体内转染IFN-γ，转染后1 d，取腹腔巨噬细胞培养，也可以有效激活巨噬细胞产生NO(表2)。转染IFN-γ后2 d，注射CH50，6 h后取出巨噬细胞培养，亦可有效激活巨噬细胞产生NO。
将小鼠体内转染IFN-γ基因， 第2天注射1次CH50，进行第1次体内激活。间隔2 d后，再次转染IFN-γ基因，转染后第2天将小鼠分为两组，一组注射PBS，另一组注射CH50，6 h后取出巨噬细胞培养，检测NO的产生，加PBS注射组为2.1±1.2 μmol/L，加CH50注射组则为 16.2±4.1 μmol/L，P<0.01。表明再次转染加CH50注射起到了第2次激活的作用，第2次给予双信号仍可有效激活巨噬细胞，第1次激活的巨噬细胞对再次激活作用不产生抑制。
图1 IFN-γ体内转染后不同时间注射CH50对
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巨噬细胞的激活作用
Fig.1 Activation of macrophages by CH50 injected in different
time after transfection of IFN-γ gene in vivo
2.3 治疗肿瘤的作用
腹腔接种黑色素瘤B16/F1细胞后，以不同剂量腹腔单独注射CH50，连续10 d，能够抑制肿瘤结节的形成，其抑制作用呈剂量依赖关系(图2)。低剂量CH50对 <1 mm 的结节已有很强的抑制作用；剂量加大时，对1～3 mm 和 >3 mm 的肿瘤结节的抑制作用均增强，且作用效果相同。
表2 CH50和IFN-γ在体内先后刺激对巨噬细胞的激活作用
, 百拇医药
Tab. 2 Activation of CH50 and IFN-γ on macrophages
by successive stimulation in vivo Group
n
First
Second
NO(μmol/L)
1
8
PBS
PBS
1.3±0.6
, 百拇医药
2
8
CH50
PBS
2.7±1.3
3
8
CH50
IFN-γ
10.6±2.1△
4
8
IFN-γ
, http://www.100md.com
CH50
19.9±2.7△
5
8
IFN-γ
PBS
3.9±1.2
△P<0.01 compared with group 1
图2 CH50对腹腔接种黑色素瘤后肿瘤结节的抑制作用
Fig. 2 Inhibition of CH50 on the formation of melanoma
, 百拇医药
nodes after inoculation in peritoneal cavity
表3 CH50体内激活巨噬细胞对艾氏腹水瘤和黑色素瘤的抑制作用
Tab. 3 Inhibition of CH50 on Ehrlich ascites carcinoma and melanoma by activating macrophages in vivo
Volume of ascites or number of melanoma nodes
Parameters
Control
IFN-γ
CH50
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IFN-γ+CH50
Ehrlich (n=9)
ascites (ml)
3.5±0.7
3.2±0.6
3.3±0.6
0.6±0.8▲
Melanoma(n=8)
nodes <1 mm
137.4±24.1
54.2±15.6▲
, 百拇医药
13.8±7.3▲
21.8±9.1△
nodes >1 mm
46.1±11.7
31.8±11.1△
23.8±6.3▲
5.2±3.5▲
total nodes
183.5±24.6
86.2±22.1▲
, 百拇医药
37.6±2.7▲
27.6±8.7▲
▲ P<0.01 compared with control； △ P<0.05 小鼠腹腔接种黑色素瘤B16/F1或艾氏腹水癌后，对照组注射PBS，治疗组分别以3种方案治疗：① 接种后1，4，7 d体内转染IFN-γ基因；② 接种后注射CH50，每天1次，连续8 d，③ 转染基因和注射CH50同时进行，方案同前2组。从表3可见，IFN-γ转染和注射CH50单独对艾氏腹水癌的治疗作用都很弱，协同作用时才能有效抑制艾氏腹水癌的生长；而对黑色素瘤，两者都有治疗作用，CH50对小结节的抑制作用明显比IFN-γ强，而两者协同作用时主要是对较大的肿瘤结节产生更强的抑制作用。
3 讨 论
我们前面的研究工作[2,3]已经证明，CH50可以抑制肿瘤细胞的浸润能力，能够激活巨噬细胞的杀瘤功能，与IFN-γ有协同激活巨噬细胞以及在体内抑制肿瘤细胞生长的作用。本文研究工作进一步探讨了CH50在体内激活巨噬细胞以及抑制肿瘤生长的特点。CH50不仅可以在体外有效激活巨噬细胞[3]，在体内同样可以有效地激活巨噬细胞。但CH50单独作用时，激活巨噬细胞需要一段较长的时间，而在有IFN-γ存在的情况下，CH50在体内激活巨噬细胞的作用则非常迅速，体内作用6 h，即可有效地激活巨噬细胞。
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小鼠体内转染IFN-γ基因后，对巨噬细胞的激活作用在第4天达到高峰，注射CH50，激活作用更强，而且保持同样的峰。这进一步证明了CH50和IFN-γ协同激活巨噬细胞的作用。有IFN-γ存在时，巨噬细胞对CH50可以产生更强的反应，IFN-γ的作用越强，CH50的作用亦越强。体内转染IFN-γ可以使巨噬细胞在较长时间内对CH50保持较好的反应性。
巨噬细胞需要双信号的作用才能充分激活[7]。没有适当的双信号,不能充分激活巨噬细胞介导的肿瘤细胞毒(MTC)功能。 对巨噬细胞激活双信号的研究虽然很多, 但目前仍没有适合肿瘤治疗用的双信号因子，另一方面, 在双信号激活中与IFN-γ协同作用的因子(如LPS,TNF等), 如果先于IFN-γ作用于巨噬细胞, 容易引起巨噬细胞的免疫耐受，抑制MTC功能的充分激活[8]， 在肿瘤治疗中很难控制。研究结果表明，CH50和IFN-γ在体内协同作用激活巨噬细胞时，作用不分先后，而且可以达到重复激活的效果，先激活的巨噬细胞亦未抑制以后对巨噬细胞的激活作用。这种重复激活巨噬细胞的特点使得CH50和IFN-γ有希望成为适合于临床治疗肿瘤用的巨噬细胞激活双信号因子。
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CH50和IFN-γ单独作用，都可抑制实体瘤的生长，对腹水癌细胞的抑制作用则较弱，协同作用时则有很强的抑制作用。表明对于体内游离生长的癌细胞(如白血病细胞，通过血液转移的癌细胞等)，须充分激活巨噬细胞才能对其产生有效的杀伤作用。同时表明，以CH50和IFN-γ双信号激活巨噬细胞，在白血病缓解期继续杀伤体内残存的癌细胞，可能具有较好的应用前景。
参 考 文 献
1，张桂梅, 冯作化, 李 东, 等. 双功能结构域重组FN多肽表达质粒的构建及其表达产物的功能. 生物工程学报， 1996， 12(suppl): 121
2，张桂梅, 冯作化, 张 慧, 等. 双功能域重组FN 多肽抑制癌细胞浸润能力的研究. 同济医科大学学报， 1998， 27(1): 6
3，冯作化， 张桂梅， 张 慧， 等. 重组FN多肽CH50对巨噬细胞抗肿瘤功能的促进作用. 中国免疫学杂， 1998， 14(4)： 268
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4，Jiao H, Shen W, Ohe Y， et al. A new MTT assay for testing macrophage cytotoxicity to L1210 and its drug-resistant cell lines in vitro. Cancer Immunol Immunother, 1992， 35: 412
5，Mosman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assay. J Immunol Methods， 1983， 65(1～2): 55
6，萨姆布鲁克 J，弗里奇 EF，曼尼阿蒂斯蒂 T. 分子克隆实验指南. 金冬雁， 黎孟枫等译. 第2版. 北京： 科学出版社， 1992. 792
7，周 滨, 姜志尧, 张桂梅， 等. 体内IFN-γ基因转染小鼠腹腔巨噬细胞抗肿瘤作用的研究. 中国免疫学杂志， 1998， 14(1): 22
8，刘 彦. 巨噬细胞的激活与其信息传递. 国外医学免疫学分册， 1996， (4): 214
(1999-03-30收稿； 1999-04-15修回), 百拇医药