重组RA538、反义c-myc腺病毒对不同细胞系转染效率与作用及其机制的研究
作者：陈洁平 林晨 徐采朴 张雪艳 付明 隗玥 邓友平 吴旻
单位：陈洁平 林晨 徐采朴 张雪艳 付明 隗玥 邓友平 吴旻(第三军医大学西南医院消化科 重庆 400038)
关键词：腺病毒；转染效率；胃癌；食管癌；c-myc；bcl-2
中国肿瘤生物治疗杂志000119 《中国图书资料分类法》分类号 R735.2
腺病毒载体研究的发展使基因治疗付诸于临床应用成为可能，它以遗传毒性低、致病性小、宿主范围广、滴度高、装载容量大等优势已广泛用于基因治疗。腺病毒载体能感染增生分裂细胞及非增生分裂细胞，相同的腺病毒载体对不同的靶细胞可能会产生不同的作用，阐明腺病毒载体转染效率及疗效之间存在的关系及其机制具有重要意义。我们的研究发现腺病毒(adenovirus,Ad)介导的RA538、反义(antisense,AS)c-myc具有抑制人胃癌细胞生长、诱导其凋亡及下调节c-myc、bcl-2基因表达的作用(另文发表)。本课题研究腺病毒介导LacZ基因对人胃癌、食管癌及正常人胚肺二倍体细胞系的转染效率，以及腺病毒介导RA538、反义c-myc对人胃癌(SGC7901)、食管癌(EC109)、正常人胚肺二倍体(2BS)细胞系生物学行为及对部分癌基因转录的影响，探索腺病毒载体转染效率、疗效之间存在的关系及其机制, 以及腺病毒介导RA538、反义c-myc治疗胃癌、食管癌的可行性、作用的分子机制，为胃癌和食管癌基因治疗的临床前研究提供实验依据。
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1 材料与方法
1.1 细胞系
293细胞为腺病毒E1基因转化的人胚肾细胞系。SGC7901细胞为人胃腺癌细胞系。EC109细胞为人食管癌细胞系，临床诊断为高分化鳞状细胞癌。2BS细胞为人胚肺成纤维细胞系。
1.2 重组体腺病毒的制备
RA538、反义c-myc及 LacZ重组体腺病毒(Ad-RA538， Ad-ASc-myc，Ad-LacZ)为中国医学科学院肿瘤研究所细胞生物室构建，为E1和E3区缺失的复制缺陷型腺病毒载体构建而成。经293细胞繁殖及滴度测定。提取腺病毒DNA，采用一对RA538或反义c-myc基因引物及一对腺病毒基因组引物进行PCR扩增鉴定。
1.3 腺病毒转导效率检测
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重组腺病毒Ad-LacZ按25，50，100，200 感染强度(multiplicity of infection, MOI)感染细胞。48 h后用1%多聚甲醛固定,加入X-gal染液37℃孵箱中2～4 h。显微镜下蓝染的细胞即LacZ基因表达的阳性细胞。分别计算蓝染细胞的百分率。
1.4 细胞生长曲线(MTT法)
接种细胞于96孔板中，24 h内按不同MOI感染腺病毒。于不同时间点每孔加入MTT溶液(0.5 mg/ml),4 h后弃去，另加入DMSO, 振摇数分钟后酶标仪检测每孔OD值。
1.5 逆转录PCR(RT-PCR)分析
按Promega公司的RNA gents TM Total RNA Isolation system 试剂盒说明分别提取并纯化细胞系的总RNA。采用Promega公司M-MLV逆转录试剂盒说明将细胞总RNA中的mRNA逆转录成cDNA。PCR条件：25 μl体系中cDNA 2 μl, 10×PCR buffer,15 mmol/L MgCl2,4种dNTPs各25 μmol/L,每次加两对引物(目的基因及β-actin)各50 μmol/L,Taq酶1 U, 反应在PCR仪中进行。95℃ 5 min,95℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，28～30个循环。
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2 结果与讨论
2.1 重组体腺病毒的转导效率
重组体腺病毒Ad-RA538，Ad-ASc-myc，Ad-LacZ经293细胞扩增、纯化及滴度测定，PCR鉴定后备用。采用插入LacZ报告基因的重组体腺病毒，按不同MOI感染细胞，X-gal染色法进行重组体腺病毒对不同细胞转导效率的检测。在MOI 25，50，100，200时，SGC7901细胞分别为90%，100%，100%，100%。EC109细胞分别为10%，30%，50%，80%。2BS细胞的转导效率分别为50%，60%，90%，90%。表明腺病毒转导效率高，能实现目的基因在转导细胞中的高水平表达。LacZ重组腺病毒转导SGC7901，EC109及2BS细胞，观察到不同程度的转染效率, EC109细胞转导效率明显低于SGC7901及2BS细胞，这种转染效率的差别直接影响了重组腺病毒对受体细胞的生物学作用。这可能是腺病毒在基因治疗中产生不同疗效的原因之一。重组腺病毒也可以感染非增殖分裂的细胞，表现在对正常人胚肺成纤维细胞2BS有较高的转染效率上。文献报道也显示了腺病毒载体的高效转导及高效表达[1]。
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2.2 Ad-RA538及Ad-ASc-myc对SGC7901，EC109，2BS细胞形态学影响及生长的抑制作用
采用Ad-RA538及Ad-ASc-myc MOI 100感染SGC7901细胞，均于1～3 d开始出现细胞聚集,变圆,胞浆中有空泡,4～5 d后细胞浮起。Ad-LacZ感染MOI 100时,细胞不出现明显的形态学变化。用MTT法显示Ad-RA538及Ad-ASc-myc 对SGC7901细胞均具有明显的生长抑制作用，其生长抑制率分别为76.3%和44.1%(MOI 200，8 d)(与Ad-LacZ组比P<0.01)。在对食管癌EC109的研究中，形态学观察显示Ad-RA538不能诱导EC109细胞的凋亡。MTT试验显示Ad-RA538对EC109细胞的生长无明显抑制作用，其生长抑制率均为0%。相同的腺病毒对不同的靶细胞显示了完全不同的抑制作用，这除了与腺病毒对SGC7901及EC109的转导效率之间存在较大差别有关外，可能还与目的基因对靶细胞内部基因表达的调节有关。以 Ad-RA538及Ad-ASc-myc MOI 25～200感染强度分别感染2BS细胞结果显示，Ad-RA538, Ad-ASc-myc对2BS细胞的形态、生长曲线(MTT法)均无明显影响。表明Ad-RA538和Ad-ASc-myc在对癌细胞有效杀灭的剂量范围内，对正常2BS细胞的生长无明显抑制作用，引证了重组腺病毒载体的安全性。同时也说明目的基因RA538及反义c-myc对正常细胞生长没有明显抑制作用。Clarke等[2]的报告与本实验结果相似。
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2.3 Ad-RA538及Ad-ASc-myc对SGC7901，EC109，2BS细胞c-myc，bcl-2基因表达的影响
RT-PCR分析显示，在SGC7901细胞中Ad-RA538，Ad-ASc-myc能有效抑制c-myc，bcl-2基因的表达。胃癌中有c-myc基因的扩增及高表达。通过RA538及反义c-myc的表达实现c-myc基因的下调节，从而诱导胃癌细胞凋亡，这与目前多数文献报道的在凋亡过程中c-myc基因表达增加不同[3]。也有资料显示反义c-myc可以诱导肿瘤细胞凋亡[4]，与我们研究中的RA538及反义c-myc抑制 c-myc基因表达的结果一致。出现这一矛盾结果可能的解释是，c-myc基因能诱导凋亡，但在c-myc高表达的肿瘤细胞，急剧的c-myc基因表达降低对其来说是致命的。现有的研究发现bcl-2高表达可以引起肿瘤并且能延长细胞的生存期，bcl-2基因及其蛋白可抑制多种细胞的凋亡，是细胞凋亡的潜在抑制子。我们发现重组RA538及反义c-myc的表达可以抑制SGC7901细胞bcl-2基因的表达。重组RA538及反义c-myc腺病毒对SGC7901细胞所实现的生长抑制及凋亡诱导作用可能是通过对它的高效转染及抑制内源性c-myc，bcl-2基因的表达而共同实现的。RT-PCR分析显示，EC109细胞经Ad-RA538处理后，c-myc，bcl-2基因的表达均无明显变化，表明Ad-RA538不能抑制EC109细胞的生长并诱导其凋亡,这除了与转导效率有关外，可能还与Ad-RA538对EC109细胞内源性高表达的c-myc，bcl-2基因表达无抑制作用有关。2BS细胞中内源性的c-myc及bcl-2基因表达量极低，常规RT-PCR方法不能显示其表达，经过加大模板量，增加循环数、降低退火温度等处理后发现，Ad-RA538对内源性c-myc及bcl-2基因的表达无任何调节作用。以上结果表明对于c-myc和bcl-2表达量极低的正常2BS细胞，相应的目的基因转入对它们相关基因的表达没有影响。这可能是Ad-RA538不损伤正常2BS细胞的机制之一。
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参 考 文 献
1，Cheng DY, Kolls JK, Lei D, et al. In vivo and in vitro gene transfer and expression in rat intestinal epithlial cells by E1-deleted adenoviral vector. Hum Gene Ther, 1997, 8(6): 755
2，Clarke MF, Apel IJ, Benedict MA, et al. A recombinant BCL-XS adnovirus selectively induces apoptosis in cancer cells but not in normal bone marrow cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92(24): 11024
3，Ryan Km, Birnie GD. myc oncogens: The enigmatic family. Biochem J, 1996, 314: 713
4，Kimura S, Maekawa T, Hirakawa K, et al. Alteration of c-myc expression by antisense enhance the induction of apoptosis in HL-60 cells. Cancer Res， 1995, 55(15): 1379
(1999-03-29收稿； 1999-08-02修回), http://www.100md.com
单位：陈洁平 林晨 徐采朴 张雪艳 付明 隗玥 邓友平 吴旻(第三军医大学西南医院消化科 重庆 400038)
关键词：腺病毒；转染效率；胃癌；食管癌；c-myc；bcl-2
中国肿瘤生物治疗杂志000119 《中国图书资料分类法》分类号 R735.2
腺病毒载体研究的发展使基因治疗付诸于临床应用成为可能，它以遗传毒性低、致病性小、宿主范围广、滴度高、装载容量大等优势已广泛用于基因治疗。腺病毒载体能感染增生分裂细胞及非增生分裂细胞，相同的腺病毒载体对不同的靶细胞可能会产生不同的作用，阐明腺病毒载体转染效率及疗效之间存在的关系及其机制具有重要意义。我们的研究发现腺病毒(adenovirus,Ad)介导的RA538、反义(antisense,AS)c-myc具有抑制人胃癌细胞生长、诱导其凋亡及下调节c-myc、bcl-2基因表达的作用(另文发表)。本课题研究腺病毒介导LacZ基因对人胃癌、食管癌及正常人胚肺二倍体细胞系的转染效率，以及腺病毒介导RA538、反义c-myc对人胃癌(SGC7901)、食管癌(EC109)、正常人胚肺二倍体(2BS)细胞系生物学行为及对部分癌基因转录的影响，探索腺病毒载体转染效率、疗效之间存在的关系及其机制, 以及腺病毒介导RA538、反义c-myc治疗胃癌、食管癌的可行性、作用的分子机制，为胃癌和食管癌基因治疗的临床前研究提供实验依据。
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1 材料与方法
1.1 细胞系
293细胞为腺病毒E1基因转化的人胚肾细胞系。SGC7901细胞为人胃腺癌细胞系。EC109细胞为人食管癌细胞系，临床诊断为高分化鳞状细胞癌。2BS细胞为人胚肺成纤维细胞系。
1.2 重组体腺病毒的制备
RA538、反义c-myc及 LacZ重组体腺病毒(Ad-RA538， Ad-ASc-myc，Ad-LacZ)为中国医学科学院肿瘤研究所细胞生物室构建，为E1和E3区缺失的复制缺陷型腺病毒载体构建而成。经293细胞繁殖及滴度测定。提取腺病毒DNA，采用一对RA538或反义c-myc基因引物及一对腺病毒基因组引物进行PCR扩增鉴定。
1.3 腺病毒转导效率检测
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重组腺病毒Ad-LacZ按25，50，100，200 感染强度(multiplicity of infection, MOI)感染细胞。48 h后用1%多聚甲醛固定,加入X-gal染液37℃孵箱中2～4 h。显微镜下蓝染的细胞即LacZ基因表达的阳性细胞。分别计算蓝染细胞的百分率。
1.4 细胞生长曲线(MTT法)
接种细胞于96孔板中，24 h内按不同MOI感染腺病毒。于不同时间点每孔加入MTT溶液(0.5 mg/ml),4 h后弃去，另加入DMSO, 振摇数分钟后酶标仪检测每孔OD值。
1.5 逆转录PCR(RT-PCR)分析
按Promega公司的RNA gents TM Total RNA Isolation system 试剂盒说明分别提取并纯化细胞系的总RNA。采用Promega公司M-MLV逆转录试剂盒说明将细胞总RNA中的mRNA逆转录成cDNA。PCR条件：25 μl体系中cDNA 2 μl, 10×PCR buffer,15 mmol/L MgCl2,4种dNTPs各25 μmol/L,每次加两对引物(目的基因及β-actin)各50 μmol/L,Taq酶1 U, 反应在PCR仪中进行。95℃ 5 min,95℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，28～30个循环。
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2 结果与讨论
2.1 重组体腺病毒的转导效率
重组体腺病毒Ad-RA538，Ad-ASc-myc，Ad-LacZ经293细胞扩增、纯化及滴度测定，PCR鉴定后备用。采用插入LacZ报告基因的重组体腺病毒，按不同MOI感染细胞，X-gal染色法进行重组体腺病毒对不同细胞转导效率的检测。在MOI 25，50，100，200时，SGC7901细胞分别为90%，100%，100%，100%。EC109细胞分别为10%，30%，50%，80%。2BS细胞的转导效率分别为50%，60%，90%，90%。表明腺病毒转导效率高，能实现目的基因在转导细胞中的高水平表达。LacZ重组腺病毒转导SGC7901，EC109及2BS细胞，观察到不同程度的转染效率, EC109细胞转导效率明显低于SGC7901及2BS细胞，这种转染效率的差别直接影响了重组腺病毒对受体细胞的生物学作用。这可能是腺病毒在基因治疗中产生不同疗效的原因之一。重组腺病毒也可以感染非增殖分裂的细胞，表现在对正常人胚肺成纤维细胞2BS有较高的转染效率上。文献报道也显示了腺病毒载体的高效转导及高效表达[1]。
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2.2 Ad-RA538及Ad-ASc-myc对SGC7901，EC109，2BS细胞形态学影响及生长的抑制作用
采用Ad-RA538及Ad-ASc-myc MOI 100感染SGC7901细胞，均于1～3 d开始出现细胞聚集,变圆,胞浆中有空泡,4～5 d后细胞浮起。Ad-LacZ感染MOI 100时,细胞不出现明显的形态学变化。用MTT法显示Ad-RA538及Ad-ASc-myc 对SGC7901细胞均具有明显的生长抑制作用，其生长抑制率分别为76.3%和44.1%(MOI 200，8 d)(与Ad-LacZ组比P<0.01)。在对食管癌EC109的研究中，形态学观察显示Ad-RA538不能诱导EC109细胞的凋亡。MTT试验显示Ad-RA538对EC109细胞的生长无明显抑制作用，其生长抑制率均为0%。相同的腺病毒对不同的靶细胞显示了完全不同的抑制作用，这除了与腺病毒对SGC7901及EC109的转导效率之间存在较大差别有关外，可能还与目的基因对靶细胞内部基因表达的调节有关。以 Ad-RA538及Ad-ASc-myc MOI 25～200感染强度分别感染2BS细胞结果显示，Ad-RA538, Ad-ASc-myc对2BS细胞的形态、生长曲线(MTT法)均无明显影响。表明Ad-RA538和Ad-ASc-myc在对癌细胞有效杀灭的剂量范围内，对正常2BS细胞的生长无明显抑制作用，引证了重组腺病毒载体的安全性。同时也说明目的基因RA538及反义c-myc对正常细胞生长没有明显抑制作用。Clarke等[2]的报告与本实验结果相似。
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2.3 Ad-RA538及Ad-ASc-myc对SGC7901，EC109，2BS细胞c-myc，bcl-2基因表达的影响
RT-PCR分析显示，在SGC7901细胞中Ad-RA538，Ad-ASc-myc能有效抑制c-myc，bcl-2基因的表达。胃癌中有c-myc基因的扩增及高表达。通过RA538及反义c-myc的表达实现c-myc基因的下调节，从而诱导胃癌细胞凋亡，这与目前多数文献报道的在凋亡过程中c-myc基因表达增加不同[3]。也有资料显示反义c-myc可以诱导肿瘤细胞凋亡[4]，与我们研究中的RA538及反义c-myc抑制 c-myc基因表达的结果一致。出现这一矛盾结果可能的解释是，c-myc基因能诱导凋亡，但在c-myc高表达的肿瘤细胞，急剧的c-myc基因表达降低对其来说是致命的。现有的研究发现bcl-2高表达可以引起肿瘤并且能延长细胞的生存期，bcl-2基因及其蛋白可抑制多种细胞的凋亡，是细胞凋亡的潜在抑制子。我们发现重组RA538及反义c-myc的表达可以抑制SGC7901细胞bcl-2基因的表达。重组RA538及反义c-myc腺病毒对SGC7901细胞所实现的生长抑制及凋亡诱导作用可能是通过对它的高效转染及抑制内源性c-myc，bcl-2基因的表达而共同实现的。RT-PCR分析显示，EC109细胞经Ad-RA538处理后，c-myc，bcl-2基因的表达均无明显变化，表明Ad-RA538不能抑制EC109细胞的生长并诱导其凋亡,这除了与转导效率有关外，可能还与Ad-RA538对EC109细胞内源性高表达的c-myc，bcl-2基因表达无抑制作用有关。2BS细胞中内源性的c-myc及bcl-2基因表达量极低，常规RT-PCR方法不能显示其表达，经过加大模板量，增加循环数、降低退火温度等处理后发现，Ad-RA538对内源性c-myc及bcl-2基因的表达无任何调节作用。以上结果表明对于c-myc和bcl-2表达量极低的正常2BS细胞，相应的目的基因转入对它们相关基因的表达没有影响。这可能是Ad-RA538不损伤正常2BS细胞的机制之一。
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参 考 文 献
1，Cheng DY, Kolls JK, Lei D, et al. In vivo and in vitro gene transfer and expression in rat intestinal epithlial cells by E1-deleted adenoviral vector. Hum Gene Ther, 1997, 8(6): 755
2，Clarke MF, Apel IJ, Benedict MA, et al. A recombinant BCL-XS adnovirus selectively induces apoptosis in cancer cells but not in normal bone marrow cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92(24): 11024
3，Ryan Km, Birnie GD. myc oncogens: The enigmatic family. Biochem J, 1996, 314: 713
4，Kimura S, Maekawa T, Hirakawa K, et al. Alteration of c-myc expression by antisense enhance the induction of apoptosis in HL-60 cells. Cancer Res， 1995, 55(15): 1379
(1999-03-29收稿； 1999-08-02修回), http://www.100md.com