B7-1基因转染后对小鼠体内的免疫增强作用
作者：章 红 江 全 袁 铿 戴志芳 袁 芳 江紫生
单位：江西省医学科学研究所肿瘤研究室(南昌 330006)
关键词：T淋巴细胞；转染；肿瘤细胞，培养的；小鼠；免疫原性
肿瘤990603 中图分类号：R73-36 文章标识码：A 文章编号：1000-7431(1999)06-0327-04
摘要：目的 研究转染B7-1基因后的小鼠宫颈癌U14细胞在体内的免疫原性变化。方法 (1)分别用病毒感染法和电穿孔法将LNSmB7和pCEPmB7导入U14细胞，用流式细胞仪检测阳性混合克隆细胞U14/LNSmB7和U14/pCEPmB7的B7-1分子表达率；(2)取不同数量的U14、U14/LNSmB7和U14/pCEPmB7细胞分别皮下接种昆明种小鼠，4周后观察各组小鼠肿瘤大小和病理结果；(3)取1×107数量的U14、U14/LNSmB7和U14/pCEPmB7减活细胞疫苗分别免疫小鼠2次后，分离脾脏T淋巴细胞并测定细胞毒T淋巴细胞(Cyototoxic T lymphocytes,CTLs)对U14细胞的体外杀伤活性。结果 (1)各种细胞表面B7-1分子表达率分别为：U14，5.24%；U14/LNSmB7，57.39%；U14/pCEPmB7，48.52%；(2)各组小鼠肿瘤平均直径为：5×104组 U14，1.19±0.47 cm；U14/LNSmB7，0(P<0.001)；U14/pCEPmB7，0(P<0.001)。5×105组U14，2.26±0.95 cm；U14/LNSmB7，0.85±0.28 cm(P<0.01)；U14/pCEPmB7，0.98±0.37 cm(P<0.01)。5×106组 U14，3.55±1.38 cm；U14/LNSmB7，1.35±0.65 cm(P<0.01)；U14/pCEPmB7，1.52±0.68 cm(P<0.01)。5×105剂量组肿瘤病理切片显示：U14细胞肿瘤周围只有少量的淋巴细胞浸润，U14/LNSmB7细胞肿瘤周围有大量的淋巴细胞浸润。U14/pCEPmB7细胞肿瘤周围有中等量的淋巴细胞浸润。(3)用减活的U14/LNSmB7和U14/pCEPmB7基因疫苗免疫小鼠后得到的CTL细胞对U14细胞的体外杀伤活性显著高于对照组U14细胞疫苗免疫后的CTL杀伤活性。结论 转染了B7-1基因的U14细胞在同系小鼠体内的致瘤性明显下降，其诱导体内T淋巴细胞活化的免疫原性显著提高。
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EFFECT OF B7-1GENE ON MOUSE CERVICAL CANCER CELL IMMUNITY IN VIVO
ZHANG Hong,JIANG Quan,YUAN Keng,et al.
(Department of Tumor. Jiangxi Institute of Medical Sciences,Nanchang 330006)
Abstract：Objective To study the immune change of mouse cervical cancer cell U14 in vivo after transfected with B7-1 gene (the costimulator for T lymphocyte activation).Methods (1)B7-1 gene was transfected into U14 cell through LNSmB7(group A) or pCEPmB7(group B)with untransfected U14 as control group C.The postivie B7-1 rate was determined by flow cytometry.(2)Group A,B or C U14 cells respectively were inoculated subcutaneously into mice, and the tumor size and pathological change were recorded four weeks later.(3)After immunizing mice twice with group A,B or C U14 cells respectively,the spleen cytotoxic T lymphocytes(CTL)from immunized mice were tested for their cytotoxicity.Results The positive B7-1 rates, the tumor mean diameters.The lymphocyte infiltration surround tumor,and the cytotoxicity of CTL in group A and B all showed a significant statistical difference with that in group C. Conclusions The U14 transfected with B7-1 gene showed in vivo a weakened tumorigenecity and a stronger immunogenecity.
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Key words： T-lymphocytes；Transfection；Tumor cells,cultured；Immunogenicity
B7分子是T淋巴细胞活化所必需的共刺激因子，在T细胞的活化增殖过程中起着重要的第二信号的作用[1]。研究表明，仅有单一的抗原刺激，即第一信号刺激，并不能激活T淋巴细胞，有时反而会导致免疫耐受[2]。许多种人类肿瘤细胞表面都存在着B7等共刺激分子表达缺如或低下的现象，是造成机体免疫系统对肿瘤细胞异常生长无免疫应答的重要原因之一[3]。因此，将B7基因导入B7分子表达缺乏或低下的肿瘤细胞内，是提高肿瘤免疫原性，加强机体对肿瘤细胞免疫排斥反应的有效手段[4，5]。本研究选用与人宫颈癌细胞有部分相同肿瘤抗原决定族的小鼠宫颈癌U14细胞作为研究对象[6]，研究转染了B7-1基因的U14细胞的免疫原性变化，为进一步研究用转B7-1基因的宫颈癌基因疫苗防治和治疗宫颈癌打下基础。
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材料与方法
一、生化试剂和单克隆抗体 RPMI 1640培养基干粉和G418为GIBCO BRL公司产品。Hygromycin B(Hyg)和细胞毒活性检测试剂盒(LDH法)购自德国宝灵曼(Boehringer Mannheim)公司。丝裂霉素C为日本发酵株式会社产品。小牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。FITC标记的大鼠抗小鼠CD80单克隆抗体购自美国Phar Mingen公司。
二、细胞、动物和表达载体 U14细胞为本室传代培养。PA317和NIH 3T3细胞购自中科院上海细胞生物学研究所细胞库。清洁级昆明种小鼠购自江西省实验动物中心。反转录病毒载体LNSmB7由复旦大学遗传学研究所薛京伦教授惠赠。穿梭质粒pCEPmB7由本实验室构建[7]。
三、基因转移及B7-1分子表达分析 反转录病毒载体LNSmB7转染U14细胞用病毒感染法：取过滤后的PA317/LNSmB7培养上清(病毒滴度为1×105 CFU/ml)感染U14细胞，G418(300 μg/ml)选择培养2周后，将细胞稀释到96孔培养板内培养、扩增，取生长良好的孔内细胞再经G418(400 μg/ml)筛选一次，筛选后的混合克隆细胞U14/LNSmB7细胞经抗小鼠CD80单抗标记后，用流式细胞仪测定U14/LNSmB7细胞的B7-1分子表达率。穿梭质粒pCEPmB7感染U14细胞用电击法：电击条件为350 V、100 μF，选择培养基为Hyg(100 μg/ml～150 μg/ml)，转染后U14/pCEPmB7细胞的筛选、单克隆抗体标记及B7-1分子表达测定与U14/LNSmB7相同。
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四、转染B7-1基因的U14细胞在小鼠体内的致瘤性实验取生长良好的U14/LNSmB7和U14/pCEPmB7细胞，PBS洗涤后按5×104细胞/只、5×105细胞/只和5×106细胞/只的剂量分别将上述两种细胞接种到昆明种小鼠右腋皮下，每种细胞每个剂量各接种8～10只小鼠(20±2 g，雌性)，同时，将U14细胞按上述三种剂量分别接种8～10只小鼠作为对照组。4周后处死小鼠，测量每只小鼠肿瘤的平均直径，平均直径=(长径+短径)/2。测得数据采用未配对计量资料和t检验。
五、病理切片 取5×105细胞/只剂量组小鼠的肿瘤组织，经石蜡包埋后，作5 μm厚连续切片，HE染色，光镜下观察肿瘤组织周围淋巴细胞浸润情况。
六、细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphoctye,CTL)杀伤活性实验 肿瘤疫苗免疫小鼠及特异性CTL细胞分离参照文献[4]方法。分离的特异性CTL细胞对靶细胞U14的细胞毒杀伤活性采用LDH释放法，操作参照文献[8]。
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结果
一、转染B7-1基因U14细胞的B7-1分子表达情况
U14/LNSmB7和U14/pCEPmB7细胞的B7-1分子表达率分别为57.39%和48.5%，较对照组U14细胞5.24%高9～10倍，显示转染B7-1基因后，肿瘤细胞U14的B7分子表达显著提高。
二、转染B7-1基因U14细胞在小鼠体内的致瘤的情况
转染了B7-1基因的U14细胞在小鼠体内的致瘤性较对照组U14细胞明显下降，5×104剂量转基因疫苗接种的实验组小鼠均未长肿瘤，与U14对照组相比有极其显著的差异(双侧t检验，P<0.001)，5×105剂量和5×106剂量接种的实验组小鼠肿瘤平均大小较对照组的小50%～70%，统计学显示差异非常显著(双侧t检验，P<0.01)(见表1)。
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表1 转B7-1基因U14细胞的体内致瘤情况 接肿细胞
5×104剂量组
5×105剂量组
5×106剂量组
U14
U14
/LNSmB7
U14
/pCEPmB7
U14
, 百拇医药 U14/LNSmB7
U14/pCEPmB7
U14
U14/LNSmB7
U14/pCEPmB7
肿瘤直径
(cm)
1.19±0.47
0*
0*
2.26±0.95
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0.85±
0.28*
0.98±
0.37*
3.55±1.38
1.35±
0.65*
1.52±
0.68*
*P<0.001 **P<0.01 三、肿瘤基因疫苗诱导的CTL对U14细胞的体外杀伤活性测定
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用1×107肿瘤疫苗分别免疫小鼠两次后，取脾脏分离得到特异性CTL细胞，再经相应的疫苗体外刺激培养后，按不同的效：靶比例(E/T比例)将CTL细胞与U14细胞混合培养18～20 h，经测定LDH释放量获得各种E/T值下CTL对U14的杀伤活性显示，转染B7-1基因的U14/LNSmB7和U14/pCEPmB7基因疫苗所诱导的CTL对U14的杀伤活性明显高于对照组U14疫苗所诱导的CTL的杀伤活性(见图1)。
图1 转染B7-1基因U14疫苗诱导CTL对U14细胞的体外杀伤活性
四、转B7-1基因U14细胞肿瘤组织周围淋巴细胞浸润观察
5×105剂量组接种的小鼠肿瘤病理切片显示，在U14/LNSmB7肿瘤组织周围有大量的淋巴细胞浸润，在U14/pCEPmB7肿瘤组织周围有中等量的淋巴细胞浸润，而在U14肿瘤周围只有少量的淋巴细胞浸润(见封三图1)。
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图1 光镜下U14(A)，U14/LNS mB7(B)及U14/pCEPmB7(C)细胞接种小鼠后肿瘤组织周围淋巴细胞浸润的情况(×100)
讨论
已知肿瘤特异性免疫主要是以T细胞介导的细胞免疫为主，其中又以CD+8 CTL为主要效应细胞[9]。在许多肿瘤细胞中，由于存在缺乏共刺激因子表达，MHC分子表达低下或缺如等信号传导缺陷，使得T细胞不能被有效激活，从而使肿瘤细胞得以逃避机体的免疫监视[10]。U14是一种由化学致癌物甲基胆蒽诱发的小鼠宫颈癌，具有一定的抗原性[6]，但其B7分子表达很低。为了提高肿瘤细胞的免疫原性，增强其激活T淋巴细胞的能力，作者用两种不同的表达载体分别将B7-1基因导入U14细胞，结果都使转基因后的U14细胞的B7分子表达显著上升，其在小鼠体内的致瘤性明显下降。同时，用转基因后肿瘤疫苗免疫小鼠所诱导的特异性CTL对U14细胞的溶解活性较对照组U14的CTL溶解活性显著增强。提示，转染了B7-1基因的U14细胞免疫原性明显增强，诱导T细胞活化的能力显著提高，这与Chen等[4]对小鼠黑素瘤细胞转导B7-1基因的研究结果也相一致。此外，作者还观察到转染B7-1基因的肿瘤组织周围有大量的淋巴细胞浸润，而对照组U14肿瘤组织周围只有很少量的淋巴细胞浸润，这也说明仅有肿瘤抗原而缺乏B7分子表达是不能诱导T细胞活化的，同时也提示，特异性T淋巴细胞的活化和增殖是导致肿瘤被排斥的主要原因。
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目前，在基因治疗的研究和应用中，基因表达载体的安全性和基因转移及表达的效率是其中的难点。本研究选用LNSX和pCEP4这两个载体框架作为B7-1基因的表达载体，目的是比较两种不同系统的载体在U14细胞中的表达效率。逆转录病毒载体是以单拷贝基因形式感染并整合到宿主细胞染色体基因组进行复制、转录和传代的，而穿梭质粒pCEP4是以多拷贝基因形式游离于染色体外存在和转录、复制的。理论上多拷贝基因的表达效率要高于单拷贝基因，但作者的结果显示U14/pCEPmB7的B7表达率并不比U14/LNSmB7的B7表达率高。由于基因表达效率除了受基因拷贝数因素影响外，还与增强子/启动子强度、转录的有效性、mRNA的稳定性以及蛋白质加工等因素有关，至于pCEPmB7在U14细胞中的表达效率较LNSmB7低是何原因，尚待进一步研究。
感谢：受到复旦大学遗传学研究所薛京伦教授、卢大儒博士等大力支持和指导，特此致谢!
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基金项目：卫生部科研基金(B950802)；江西省科委Ⅰ级课题资金资助(E960801)
参考文献
[1]Mueller DL,Jenkins MK,Schwartz RH.Clonal expansion versus functional clonal inactivation:A costimulatory signaling pathway determines the outcome of T cell antigen receptor occupancy〔J〕.Ann Rev Immunol,1989,7:445
[2]Schwartz RH.A cell culture model for T lymphocyte clone anergy〔J〕.Science,1990,248:1349
[3]Chen L.T cell costimulation and tumor immunity〔J〕.中国肿瘤生物治疗杂志，1996，3：86
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[4]Chen L,Ashe S,Brady WA, et al. Costimulation of antitumor immunity by the B7 counterreceptor for the T lymphocyte molecules CD28 and CTLA-4〔J〕. Cell,1992,71:1093
[5]Towusend SE,Allison JP.Tumor rejection after direct costimulation of CD+8 cells by B7-1 transfected melanoma cells〔J〕.Science,1993,259:368
[6]温淦
，邬淑云，张纪宁等，单克隆抗体AU14-1测定的抗原在人宫颈病变中的表达〔J〕.中国病理生理杂志，1990，6(3)：180
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[7]章 红，江 全，袁 铿，等.穿梭质粒pCEPmB7的构建及其对小鼠宫颈癌U14细胞体内生长的影响〔J〕.江西医学院学报，1999，39(1)：1
[8]Decker T,Lohmann-Matthes ML.A quick and simple method for the quantitation of lactate dehydrogenase release in measurements of cellular cytotoxicity and tumor necrosis factor(TNF) activity 〔J〕.J Immun Meth,1988,115:61
[9]Boon T, Cerottini JC,Van den Eynde B, et al. Tumor antigens recognized by T lymphocytes〔J〕.Ann Rev Immunol,1994,12:337
[10]Chen L,Linsley PS, Hellstrom KE.Costimulation of T cells for tumor immunity〔J〕.Immunol Today,1993,14:483
(收稿日期：1999-01-04), 百拇医药
单位：江西省医学科学研究所肿瘤研究室(南昌 330006)
关键词：T淋巴细胞；转染；肿瘤细胞，培养的；小鼠；免疫原性
肿瘤990603 中图分类号：R73-36 文章标识码：A 文章编号：1000-7431(1999)06-0327-04
摘要：目的 研究转染B7-1基因后的小鼠宫颈癌U14细胞在体内的免疫原性变化。方法 (1)分别用病毒感染法和电穿孔法将LNSmB7和pCEPmB7导入U14细胞，用流式细胞仪检测阳性混合克隆细胞U14/LNSmB7和U14/pCEPmB7的B7-1分子表达率；(2)取不同数量的U14、U14/LNSmB7和U14/pCEPmB7细胞分别皮下接种昆明种小鼠，4周后观察各组小鼠肿瘤大小和病理结果；(3)取1×107数量的U14、U14/LNSmB7和U14/pCEPmB7减活细胞疫苗分别免疫小鼠2次后，分离脾脏T淋巴细胞并测定细胞毒T淋巴细胞(Cyototoxic T lymphocytes,CTLs)对U14细胞的体外杀伤活性。结果 (1)各种细胞表面B7-1分子表达率分别为：U14，5.24%；U14/LNSmB7，57.39%；U14/pCEPmB7，48.52%；(2)各组小鼠肿瘤平均直径为：5×104组 U14，1.19±0.47 cm；U14/LNSmB7，0(P<0.001)；U14/pCEPmB7，0(P<0.001)。5×105组U14，2.26±0.95 cm；U14/LNSmB7，0.85±0.28 cm(P<0.01)；U14/pCEPmB7，0.98±0.37 cm(P<0.01)。5×106组 U14，3.55±1.38 cm；U14/LNSmB7，1.35±0.65 cm(P<0.01)；U14/pCEPmB7，1.52±0.68 cm(P<0.01)。5×105剂量组肿瘤病理切片显示：U14细胞肿瘤周围只有少量的淋巴细胞浸润，U14/LNSmB7细胞肿瘤周围有大量的淋巴细胞浸润。U14/pCEPmB7细胞肿瘤周围有中等量的淋巴细胞浸润。(3)用减活的U14/LNSmB7和U14/pCEPmB7基因疫苗免疫小鼠后得到的CTL细胞对U14细胞的体外杀伤活性显著高于对照组U14细胞疫苗免疫后的CTL杀伤活性。结论 转染了B7-1基因的U14细胞在同系小鼠体内的致瘤性明显下降，其诱导体内T淋巴细胞活化的免疫原性显著提高。
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EFFECT OF B7-1GENE ON MOUSE CERVICAL CANCER CELL IMMUNITY IN VIVO
ZHANG Hong,JIANG Quan,YUAN Keng,et al.
(Department of Tumor. Jiangxi Institute of Medical Sciences,Nanchang 330006)
Abstract：Objective To study the immune change of mouse cervical cancer cell U14 in vivo after transfected with B7-1 gene (the costimulator for T lymphocyte activation).Methods (1)B7-1 gene was transfected into U14 cell through LNSmB7(group A) or pCEPmB7(group B)with untransfected U14 as control group C.The postivie B7-1 rate was determined by flow cytometry.(2)Group A,B or C U14 cells respectively were inoculated subcutaneously into mice, and the tumor size and pathological change were recorded four weeks later.(3)After immunizing mice twice with group A,B or C U14 cells respectively,the spleen cytotoxic T lymphocytes(CTL)from immunized mice were tested for their cytotoxicity.Results The positive B7-1 rates, the tumor mean diameters.The lymphocyte infiltration surround tumor,and the cytotoxicity of CTL in group A and B all showed a significant statistical difference with that in group C. Conclusions The U14 transfected with B7-1 gene showed in vivo a weakened tumorigenecity and a stronger immunogenecity.
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Key words： T-lymphocytes；Transfection；Tumor cells,cultured；Immunogenicity
B7分子是T淋巴细胞活化所必需的共刺激因子，在T细胞的活化增殖过程中起着重要的第二信号的作用[1]。研究表明，仅有单一的抗原刺激，即第一信号刺激，并不能激活T淋巴细胞，有时反而会导致免疫耐受[2]。许多种人类肿瘤细胞表面都存在着B7等共刺激分子表达缺如或低下的现象，是造成机体免疫系统对肿瘤细胞异常生长无免疫应答的重要原因之一[3]。因此，将B7基因导入B7分子表达缺乏或低下的肿瘤细胞内，是提高肿瘤免疫原性，加强机体对肿瘤细胞免疫排斥反应的有效手段[4，5]。本研究选用与人宫颈癌细胞有部分相同肿瘤抗原决定族的小鼠宫颈癌U14细胞作为研究对象[6]，研究转染了B7-1基因的U14细胞的免疫原性变化，为进一步研究用转B7-1基因的宫颈癌基因疫苗防治和治疗宫颈癌打下基础。
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材料与方法
一、生化试剂和单克隆抗体 RPMI 1640培养基干粉和G418为GIBCO BRL公司产品。Hygromycin B(Hyg)和细胞毒活性检测试剂盒(LDH法)购自德国宝灵曼(Boehringer Mannheim)公司。丝裂霉素C为日本发酵株式会社产品。小牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。FITC标记的大鼠抗小鼠CD80单克隆抗体购自美国Phar Mingen公司。
二、细胞、动物和表达载体 U14细胞为本室传代培养。PA317和NIH 3T3细胞购自中科院上海细胞生物学研究所细胞库。清洁级昆明种小鼠购自江西省实验动物中心。反转录病毒载体LNSmB7由复旦大学遗传学研究所薛京伦教授惠赠。穿梭质粒pCEPmB7由本实验室构建[7]。
三、基因转移及B7-1分子表达分析 反转录病毒载体LNSmB7转染U14细胞用病毒感染法：取过滤后的PA317/LNSmB7培养上清(病毒滴度为1×105 CFU/ml)感染U14细胞，G418(300 μg/ml)选择培养2周后，将细胞稀释到96孔培养板内培养、扩增，取生长良好的孔内细胞再经G418(400 μg/ml)筛选一次，筛选后的混合克隆细胞U14/LNSmB7细胞经抗小鼠CD80单抗标记后，用流式细胞仪测定U14/LNSmB7细胞的B7-1分子表达率。穿梭质粒pCEPmB7感染U14细胞用电击法：电击条件为350 V、100 μF，选择培养基为Hyg(100 μg/ml～150 μg/ml)，转染后U14/pCEPmB7细胞的筛选、单克隆抗体标记及B7-1分子表达测定与U14/LNSmB7相同。
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四、转染B7-1基因的U14细胞在小鼠体内的致瘤性实验取生长良好的U14/LNSmB7和U14/pCEPmB7细胞，PBS洗涤后按5×104细胞/只、5×105细胞/只和5×106细胞/只的剂量分别将上述两种细胞接种到昆明种小鼠右腋皮下，每种细胞每个剂量各接种8～10只小鼠(20±2 g，雌性)，同时，将U14细胞按上述三种剂量分别接种8～10只小鼠作为对照组。4周后处死小鼠，测量每只小鼠肿瘤的平均直径，平均直径=(长径+短径)/2。测得数据采用未配对计量资料和t检验。
五、病理切片 取5×105细胞/只剂量组小鼠的肿瘤组织，经石蜡包埋后，作5 μm厚连续切片，HE染色，光镜下观察肿瘤组织周围淋巴细胞浸润情况。
六、细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphoctye,CTL)杀伤活性实验 肿瘤疫苗免疫小鼠及特异性CTL细胞分离参照文献[4]方法。分离的特异性CTL细胞对靶细胞U14的细胞毒杀伤活性采用LDH释放法，操作参照文献[8]。
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结果
一、转染B7-1基因U14细胞的B7-1分子表达情况
U14/LNSmB7和U14/pCEPmB7细胞的B7-1分子表达率分别为57.39%和48.5%，较对照组U14细胞5.24%高9～10倍，显示转染B7-1基因后，肿瘤细胞U14的B7分子表达显著提高。
二、转染B7-1基因U14细胞在小鼠体内的致瘤的情况
转染了B7-1基因的U14细胞在小鼠体内的致瘤性较对照组U14细胞明显下降，5×104剂量转基因疫苗接种的实验组小鼠均未长肿瘤，与U14对照组相比有极其显著的差异(双侧t检验，P<0.001)，5×105剂量和5×106剂量接种的实验组小鼠肿瘤平均大小较对照组的小50%～70%，统计学显示差异非常显著(双侧t检验，P<0.01)(见表1)。
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表1 转B7-1基因U14细胞的体内致瘤情况 接肿细胞
5×104剂量组
5×105剂量组
5×106剂量组
U14
U14
/LNSmB7
U14
/pCEPmB7
U14
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U14/pCEPmB7
U14
U14/LNSmB7
U14/pCEPmB7
肿瘤直径
(cm)
1.19±0.47
0*
0*
2.26±0.95
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0.85±
0.28*
0.98±
0.37*
3.55±1.38
1.35±
0.65*
1.52±
0.68*
*P<0.001 **P<0.01 三、肿瘤基因疫苗诱导的CTL对U14细胞的体外杀伤活性测定
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用1×107肿瘤疫苗分别免疫小鼠两次后，取脾脏分离得到特异性CTL细胞，再经相应的疫苗体外刺激培养后，按不同的效：靶比例(E/T比例)将CTL细胞与U14细胞混合培养18～20 h，经测定LDH释放量获得各种E/T值下CTL对U14的杀伤活性显示，转染B7-1基因的U14/LNSmB7和U14/pCEPmB7基因疫苗所诱导的CTL对U14的杀伤活性明显高于对照组U14疫苗所诱导的CTL的杀伤活性(见图1)。
图1 转染B7-1基因U14疫苗诱导CTL对U14细胞的体外杀伤活性
四、转B7-1基因U14细胞肿瘤组织周围淋巴细胞浸润观察
5×105剂量组接种的小鼠肿瘤病理切片显示，在U14/LNSmB7肿瘤组织周围有大量的淋巴细胞浸润，在U14/pCEPmB7肿瘤组织周围有中等量的淋巴细胞浸润，而在U14肿瘤周围只有少量的淋巴细胞浸润(见封三图1)。
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图1 光镜下U14(A)，U14/LNS mB7(B)及U14/pCEPmB7(C)细胞接种小鼠后肿瘤组织周围淋巴细胞浸润的情况(×100)
讨论
已知肿瘤特异性免疫主要是以T细胞介导的细胞免疫为主，其中又以CD+8 CTL为主要效应细胞[9]。在许多肿瘤细胞中，由于存在缺乏共刺激因子表达，MHC分子表达低下或缺如等信号传导缺陷，使得T细胞不能被有效激活，从而使肿瘤细胞得以逃避机体的免疫监视[10]。U14是一种由化学致癌物甲基胆蒽诱发的小鼠宫颈癌，具有一定的抗原性[6]，但其B7分子表达很低。为了提高肿瘤细胞的免疫原性，增强其激活T淋巴细胞的能力，作者用两种不同的表达载体分别将B7-1基因导入U14细胞，结果都使转基因后的U14细胞的B7分子表达显著上升，其在小鼠体内的致瘤性明显下降。同时，用转基因后肿瘤疫苗免疫小鼠所诱导的特异性CTL对U14细胞的溶解活性较对照组U14的CTL溶解活性显著增强。提示，转染了B7-1基因的U14细胞免疫原性明显增强，诱导T细胞活化的能力显著提高，这与Chen等[4]对小鼠黑素瘤细胞转导B7-1基因的研究结果也相一致。此外，作者还观察到转染B7-1基因的肿瘤组织周围有大量的淋巴细胞浸润，而对照组U14肿瘤组织周围只有很少量的淋巴细胞浸润，这也说明仅有肿瘤抗原而缺乏B7分子表达是不能诱导T细胞活化的，同时也提示，特异性T淋巴细胞的活化和增殖是导致肿瘤被排斥的主要原因。
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目前，在基因治疗的研究和应用中，基因表达载体的安全性和基因转移及表达的效率是其中的难点。本研究选用LNSX和pCEP4这两个载体框架作为B7-1基因的表达载体，目的是比较两种不同系统的载体在U14细胞中的表达效率。逆转录病毒载体是以单拷贝基因形式感染并整合到宿主细胞染色体基因组进行复制、转录和传代的，而穿梭质粒pCEP4是以多拷贝基因形式游离于染色体外存在和转录、复制的。理论上多拷贝基因的表达效率要高于单拷贝基因，但作者的结果显示U14/pCEPmB7的B7表达率并不比U14/LNSmB7的B7表达率高。由于基因表达效率除了受基因拷贝数因素影响外，还与增强子/启动子强度、转录的有效性、mRNA的稳定性以及蛋白质加工等因素有关，至于pCEPmB7在U14细胞中的表达效率较LNSmB7低是何原因，尚待进一步研究。
感谢：受到复旦大学遗传学研究所薛京伦教授、卢大儒博士等大力支持和指导，特此致谢!
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基金项目：卫生部科研基金(B950802)；江西省科委Ⅰ级课题资金资助(E960801)
参考文献
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(收稿日期：1999-01-04), 百拇医药