抑癌基因p16INK4真核表达载体的构建及其表达
作者：朱长军 张利宁 马春红 曹英林 孙汶生
单位：朱长军 张利宁 马春红 曹英林 孙汶生(山东医科大学微生物免疫学教研室 济南 250012)
关键词：抑癌基因；p16INK4；昆虫杆状病毒表达系统；真核表达
中国肿瘤生物治疗杂志000120 《中国图书资料分类法》分类号 Q786
肿瘤是一种以细胞增殖失控为特点的疾病。细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)的抑制因子P16蛋白是1993年发现的第一种直接作用于细胞周期,抑制细胞分裂的抑癌蛋白[1],成为肿瘤研究领域又一引人注目的分子。我们首次利用中山大学生命科学院王王 旬章教授[2]构建的既能高效表达外源基因又能形成多角体的杆状病毒表达系统表达抑癌基因p16INK4，为进一步研究抑癌蛋白P16的结构与功能及其在肿瘤生物治疗中的意义奠定了坚实的基础。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒与菌株
含p16cDNA的转移载体质粒pSXIVVI+X3-p16由本室构建,含此质粒的工程菌由本室保存。
1.1.2 病毒与细胞
含合成启动子和β-半乳糖苷酶基因的无包涵体粉纹夜蛾重组病毒TnNPV-SVI-G由中山大学生命科学院惠赠。sf 9细胞引自华中师范大学昆虫所。Hela细胞由第二军医大学免疫学教研室提供。
1.1.3 培养基及其它试剂
昆虫细胞培养基TC-100及胎牛血清FBS均为GIBCO公司产品。P16单克隆抗体购自Santa Cruz公司。Western Blot显色试剂盒购自LAB VISION公司。其它试剂均为国产试剂。
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1.1.4 p16cDNA PCR引物
引物1(5′CGGAATTCATCCAGCCTTCGGCTGAC3′),引物2(5′CGTTAC AATCGGGGATGTCTGAG3′)均自行设计,由中科院微生物研究所基因工程中心合成并纯化。
1.2 方法
1.2.1 质粒pSXIVVI+X3-p16的扩增与抽提
按照Sambrook等[3]方法进行。
1.2.2 亲本病毒TnNPV-SVI-G DNA的回收与鉴定
病毒感染细胞 4 d后，细胞病变(CPE)近100%时，加固体聚乙二醇(MW 6 000)沉淀培养液中病毒颗粒，进行蛋白消化、DNA抽提，并用HindⅢ酶切鉴定。
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1.2.3 TnNPV-p16的构建
sf 9细胞的培养、共转染及重组病毒TnNPV-p16的筛选纯化。
重组病毒TnNPV-p16的鉴定:以p16cDNA引物对TnNPV-p16DNA进行PCR扩增，条件为94℃ 40 s, 55℃ 40 s, 72℃ 60 s，30个循环，最后72℃延伸5 min，将扩增产物电泳，观察。
1.2.4 抑癌蛋白P16的检测
将空斑筛选纯化得到的重组毒株TnNPV-p16与亲本毒株TnNPV-SVI-G分别感染sf 9细胞,6 d后收集细胞及细胞培养液并裂解胞体，用三氯乙酸浓缩细胞培养液,以Hela细胞为对照,进行SDS-PAGE及Western blot分析,参照Sambrook[3]等。
, 百拇医药 2 结果与讨论
2.1 TnNPV-p16的构建
质粒pSXIVVI+X3-p16 DNA与病毒TnNPV-SVI-G DNA共转染sf 9细胞后第5天见细胞内多角体出现。收集上清用含X-gal半固体培养基进行空斑筛选，挑选白斑即含有TnNPV-p16。反复筛选4次，得到纯化的重组毒株TnNPV-p16。
2.2 重组病毒的鉴定
sf 9感染鉴定,将纯化的重组毒株感染sf 9细胞，4～6 d可见细胞内有多角体出现，并逐渐增多。
PCR鉴定,以p16cDNA引物扩增TnNPV-p16 DNA，电泳可见约457 bp大小的特异带，大小与p16cDNA相符，而阴性对照无此特异带。
2.3 抑癌蛋白P16的真核表达
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以TnNPV-SVI-G感染的sf 9细胞裂解物为阴性对照，Hela细胞裂解物为阳性对照，将TnNPV-p16感染的sf 9细胞裂解物及蛋白浓缩后的培养上清进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并进行免疫印迹分析，结果显示于15.8 kD处,重组病毒感染的细胞有一条与Hela细胞相同的蛋白条带,而亲本株感染的细胞无，此蛋白大小及特异性与抑癌蛋白P16相符合。证明抑癌蛋白P16在昆虫细胞中成功得到表达。
癌症的发生不仅与癌基因的过度表达有关，而且与抑癌基因的失活密切相关。迄今为止，人们已发现了100多种癌基因与10多种抑癌基因，其中p16基因是1993年Serrano等发现的一种新型抑癌基因。1994年，Kamb等确定p16基因位于人9p21上，外显子编码CDK4的抑制蛋白P16蛋白,有148个氨基酸，分子量为15.8 kD。研究证实，将p16INK4基因或其表达产物P16蛋白导入某些肿瘤细胞株，可抑制其生长。但若要详细研究P16蛋白的结构与功能并探索其在肿瘤生物治疗中的潜在作用，必须获得大量有天然活性的P16蛋白。
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当今获取有活性蛋白质的首选方法是利用生物工程技术使目的基因在一定的表达系统中高效表达。我们首次利用王王 旬章教授构建的新型昆虫杆状病毒表达系统成功地表达了抑癌基因p16INK4。此系统具有正常的翻译后修饰、加工系统，表达产物不需要进一步处理即有天然构型和生物活性，同时，此系统含高效人工合成启动子及多角体蛋白启动子，大大提高了外源基因的表达水平，且杆状病毒对人、畜安全可靠，选择标记明显，易筛选，故优于大肠杆菌、腺病毒等其它表达系统。
众所周知，p16INK4基因片段较小，操作较为方便，其表达产物P16蛋白稳定且有专一的作用目标CDK4，各项研究成果均证实P16蛋白具有生长抑制功能，因此人们设想生产出模拟P16蛋白功能的药物以替代缺失或变异的p16INK4基因从而达到抑癌的目的。我们的研究首次将p16cDNA插入杆状病毒中，并在昆虫细胞中成功表达出完整P16蛋白，经SDS-PAGE与Western blot分析，分子量大小及特异性与前报道相同[1]，因此完全可以应用于进一步探讨P16蛋白的结构与功能，并使研究P16蛋白在肿瘤生物治疗中的作用成为可能。相信其一定能成为理想的令人满意的抑癌蛋白生物制品应用于肿瘤的基础研究与临床治疗。
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参 考 文 献
1，Serrano M, Hannon GY, Beach D, et al. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclinD/CDK4. Nature, 1993, 363(16): 704
2，王珣章, 谢伟东, 龙綮新, 等. 形成多角体的杆状病毒系统的建立. 病毒学报, 1991， 7(3): 253
3，Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, et al. Molecular cloning: A laboratory mannual, 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Lab Press, 1989
(1999-09-07收稿； 1999-11-26修回), 百拇医药
单位：朱长军 张利宁 马春红 曹英林 孙汶生(山东医科大学微生物免疫学教研室 济南 250012)
关键词：抑癌基因；p16INK4；昆虫杆状病毒表达系统；真核表达
中国肿瘤生物治疗杂志000120 《中国图书资料分类法》分类号 Q786
肿瘤是一种以细胞增殖失控为特点的疾病。细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)的抑制因子P16蛋白是1993年发现的第一种直接作用于细胞周期,抑制细胞分裂的抑癌蛋白[1],成为肿瘤研究领域又一引人注目的分子。我们首次利用中山大学生命科学院王王 旬章教授[2]构建的既能高效表达外源基因又能形成多角体的杆状病毒表达系统表达抑癌基因p16INK4，为进一步研究抑癌蛋白P16的结构与功能及其在肿瘤生物治疗中的意义奠定了坚实的基础。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒与菌株
含p16cDNA的转移载体质粒pSXIVVI+X3-p16由本室构建,含此质粒的工程菌由本室保存。
1.1.2 病毒与细胞
含合成启动子和β-半乳糖苷酶基因的无包涵体粉纹夜蛾重组病毒TnNPV-SVI-G由中山大学生命科学院惠赠。sf 9细胞引自华中师范大学昆虫所。Hela细胞由第二军医大学免疫学教研室提供。
1.1.3 培养基及其它试剂
昆虫细胞培养基TC-100及胎牛血清FBS均为GIBCO公司产品。P16单克隆抗体购自Santa Cruz公司。Western Blot显色试剂盒购自LAB VISION公司。其它试剂均为国产试剂。
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1.1.4 p16cDNA PCR引物
引物1(5′CGGAATTCATCCAGCCTTCGGCTGAC3′),引物2(5′CGTTAC AATCGGGGATGTCTGAG3′)均自行设计,由中科院微生物研究所基因工程中心合成并纯化。
1.2 方法
1.2.1 质粒pSXIVVI+X3-p16的扩增与抽提
按照Sambrook等[3]方法进行。
1.2.2 亲本病毒TnNPV-SVI-G DNA的回收与鉴定
病毒感染细胞 4 d后，细胞病变(CPE)近100%时，加固体聚乙二醇(MW 6 000)沉淀培养液中病毒颗粒，进行蛋白消化、DNA抽提，并用HindⅢ酶切鉴定。
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1.2.3 TnNPV-p16的构建
sf 9细胞的培养、共转染及重组病毒TnNPV-p16的筛选纯化。
重组病毒TnNPV-p16的鉴定:以p16cDNA引物对TnNPV-p16DNA进行PCR扩增，条件为94℃ 40 s, 55℃ 40 s, 72℃ 60 s，30个循环，最后72℃延伸5 min，将扩增产物电泳，观察。
1.2.4 抑癌蛋白P16的检测
将空斑筛选纯化得到的重组毒株TnNPV-p16与亲本毒株TnNPV-SVI-G分别感染sf 9细胞,6 d后收集细胞及细胞培养液并裂解胞体，用三氯乙酸浓缩细胞培养液,以Hela细胞为对照,进行SDS-PAGE及Western blot分析,参照Sambrook[3]等。
, 百拇医药 2 结果与讨论
2.1 TnNPV-p16的构建
质粒pSXIVVI+X3-p16 DNA与病毒TnNPV-SVI-G DNA共转染sf 9细胞后第5天见细胞内多角体出现。收集上清用含X-gal半固体培养基进行空斑筛选，挑选白斑即含有TnNPV-p16。反复筛选4次，得到纯化的重组毒株TnNPV-p16。
2.2 重组病毒的鉴定
sf 9感染鉴定,将纯化的重组毒株感染sf 9细胞，4～6 d可见细胞内有多角体出现，并逐渐增多。
PCR鉴定,以p16cDNA引物扩增TnNPV-p16 DNA，电泳可见约457 bp大小的特异带，大小与p16cDNA相符，而阴性对照无此特异带。
2.3 抑癌蛋白P16的真核表达
, http://www.100md.com
以TnNPV-SVI-G感染的sf 9细胞裂解物为阴性对照，Hela细胞裂解物为阳性对照，将TnNPV-p16感染的sf 9细胞裂解物及蛋白浓缩后的培养上清进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并进行免疫印迹分析，结果显示于15.8 kD处,重组病毒感染的细胞有一条与Hela细胞相同的蛋白条带,而亲本株感染的细胞无，此蛋白大小及特异性与抑癌蛋白P16相符合。证明抑癌蛋白P16在昆虫细胞中成功得到表达。
癌症的发生不仅与癌基因的过度表达有关，而且与抑癌基因的失活密切相关。迄今为止，人们已发现了100多种癌基因与10多种抑癌基因，其中p16基因是1993年Serrano等发现的一种新型抑癌基因。1994年，Kamb等确定p16基因位于人9p21上，外显子编码CDK4的抑制蛋白P16蛋白,有148个氨基酸，分子量为15.8 kD。研究证实，将p16INK4基因或其表达产物P16蛋白导入某些肿瘤细胞株，可抑制其生长。但若要详细研究P16蛋白的结构与功能并探索其在肿瘤生物治疗中的潜在作用，必须获得大量有天然活性的P16蛋白。
, http://www.100md.com
当今获取有活性蛋白质的首选方法是利用生物工程技术使目的基因在一定的表达系统中高效表达。我们首次利用王王 旬章教授构建的新型昆虫杆状病毒表达系统成功地表达了抑癌基因p16INK4。此系统具有正常的翻译后修饰、加工系统，表达产物不需要进一步处理即有天然构型和生物活性，同时，此系统含高效人工合成启动子及多角体蛋白启动子，大大提高了外源基因的表达水平，且杆状病毒对人、畜安全可靠，选择标记明显，易筛选，故优于大肠杆菌、腺病毒等其它表达系统。
众所周知，p16INK4基因片段较小，操作较为方便，其表达产物P16蛋白稳定且有专一的作用目标CDK4，各项研究成果均证实P16蛋白具有生长抑制功能，因此人们设想生产出模拟P16蛋白功能的药物以替代缺失或变异的p16INK4基因从而达到抑癌的目的。我们的研究首次将p16cDNA插入杆状病毒中，并在昆虫细胞中成功表达出完整P16蛋白，经SDS-PAGE与Western blot分析，分子量大小及特异性与前报道相同[1]，因此完全可以应用于进一步探讨P16蛋白的结构与功能，并使研究P16蛋白在肿瘤生物治疗中的作用成为可能。相信其一定能成为理想的令人满意的抑癌蛋白生物制品应用于肿瘤的基础研究与临床治疗。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Serrano M, Hannon GY, Beach D, et al. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclinD/CDK4. Nature, 1993, 363(16): 704
2，王珣章, 谢伟东, 龙綮新, 等. 形成多角体的杆状病毒系统的建立. 病毒学报, 1991， 7(3): 253
3，Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, et al. Molecular cloning: A laboratory mannual, 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Lab Press, 1989
(1999-09-07收稿； 1999-11-26修回), 百拇医药